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时间:2018-09-18
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1、实验一食品中细菌总数的检验一、实验目的要求1、了解细菌总数检验的意义。2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能4、熟练无菌操作技术。二、原理菌落总数是指食品经过处理,在一定条件下培养后,所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为杂菌数,需氧菌数等。三、试剂和仪器(一)最先准备的器材(清洗、烘干、包扎、灭菌)规格名称数量用途1、50
2、0ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶1个配制生理盐水3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂4、18×180mm试管3支稀释样品5、1ml移液管5支6、直径为90mm平皿10套倒营养平板7、250ml量筒1支8、玻璃珠:直径约5mm(二)应灭菌、消毒的器材剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸:适量酒精消毒的器材:吸耳球1个,滴管胶头4只,开瓶器(三)应制备的培养基培养基总量所用容器1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶2、平板计数琼脂(PCA)培养基:2瓶100ml/瓶250ml三角瓶四、实验内容(一)、基本操作过程:样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→
3、→计数报告。(二)、样品的稀释(样品的处理)样品:袋装乳粉外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口,用无菌剪刀开封取样。称取检样25g,放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中,然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入(先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状,再全部加入,以免奶粉结团),采用振摇法(用力快速振摇50次,振幅不小于40cm)振摇均匀,即为1:10的稀释液。固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min,制成1:10的均匀稀释液。2、用1ml灭菌吸管,吸取1∶10稀释液1ml,注入含有
4、9ml灭菌生理盐水的试管内,振摇试管混合均匀,制成1∶100稀释液。3、另取1ml灭菌吸管,按上项操作顺序作10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次,即换用另一支1ml灭菌吸管。4、根据对检样污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内,每个稀释度做2个平皿。5、用1ml生理盐水作空白对照试验,做2个平皿。u注意:①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部,也不得触及管内稀释液。②吸管插入检样液内取样稀释时,插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。③进行稀释时,应使吸管内的液体沿管壁小心流加入,以免增加检液。④每递增
5、稀释一次,即换用一支1ml灭菌吸管。(三)、倒平板稀释液移入平皿后,应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基(放置于46℃水浴保温)倾注入平皿约15ml,并转动平皿使混合均匀。u注意:①培养基不能触及平皿口边沿,加入培养基后可正反两个方向旋转,但不可用力过度,以免溅起触及上盖。②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿,所用时间不宜超过20min。(四)、培养待琼胶凝固后,翻转平皿,置36±1℃温箱内培养48h后取出,立即计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。u注意:(1)琼脂凝固后,就立即将平板放入培养箱内进行培养,以免细菌蔓延生长。(2)如果把不能立即计数,要将平板放
6、入0~4℃冰箱中,但不能超过24h。l不同产品菌落总数测定的培养时间:肉、乳、蛋及制品:37℃培养48h水产品:30℃培养48h:清凉饮料、调味品、糕点、果脯、酒类等:37℃培养24h五、结果报告1、平皿菌落数的选择(1)选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿,大于300的可记为多不可计。(2)其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,则可以计算半个平板后乘以2,以代表一个平板的菌落数。(3)当平板上有链状菌落生长时,如呈链状生长的菌落之间
7、无任何明显界限,则应作为一个菌落计,如存在有几条不同来源的链,则每条链均应按一个菌落计算,不要把链上生长的每一个菌落分开计数。2、菌落总数的计算(1)若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)中菌落总数结果。(2)若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按如下公式计算:N=∑C/(n1+0.1n2)d…………(1)式中:N―样品中菌落
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