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1、基因克隆的几种常用方法基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基
2、因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有:(1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html;(3)Swissportgood,noloosening.6.5.
3、2DCSsidewiringtocompletetheenclosureandtheothersideafterthewiringiscompleted,DCSwithintheenclosurewhenthepowermoduleshouldbeloosenedorthepowergoesout.6.6lowvoltagecableterminalmaking6.6.1first和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以
4、Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nestedPCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该
5、蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degeneratedprimer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用TaqDNA聚合酶,而采用其他有自我检测(readingproof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2
6、 根据已知探针克隆基因good,noloosening.6.5.2DCSsidewiringtocompletetheenclosureandtheothersideafterthewiringiscompleted,DCSwithintheenclosurewhenthepowermoduleshouldbeloosenedorthepowergoesout.6.6lowvoltagecableterminalmaking6.6.1first 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标
7、记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(high stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节省时间。 3 未知序列的基因打靶 根据已知序列进行基因克隆,多数是重复别人的工作,或者是在别人工作的基础上继续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过程。对未知序列的基因克隆才是真正的创造性研究。
8、 3．1 随机引物法克隆未知序列基因 随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因
