不同动物血清补体对大肠杆菌的杀灭效果

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1、第19卷第6期山东科学Vol.19No.62(X万年12月份认N以)NGS(】ENCED匕〕.五兀巧文章编号:1仪犯闷任巧恤犯巧)陈01件仍不同动物血清补体对大肠杆菌的杀灭效果马雪云‘，牛钟相2(1.山东省枣庄学院生物系，山东枣庄2771印;2.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018)摘要:探索不同动物血清补体对大肠杆菌的杀灭效果可以为开发利用补体作为新型疫苗佐剂提供理论依据。将培养活化的C口8大肠杆菌用甲醛灭活，以蜂胶为佐剂制备大肠杆菌颗粒性疫苗，用其免疫11日龄海蓝褐蛋用公雏，制备大肠杆菌抗血清;将大肠

2、杆菌抗血清灭活补体，与已知数量的大肠杆菌反应，形成抗原抗体复合物，然后加人不同动物的新鲜血清，细菌计数，观察不同动物血清补体对大肠杆菌的清除能力;微量板法测定不同动物血清补体总活性。结果表明，抗体与细菌抗原结合后，对细菌的杀灭作用较小，动物体内的补体，是细菌性疫苗发挥免疫效果的关键物质;哺乳动物血清中的补体对细菌的清除能力高于鸡，在哺乳动物中，豚鼠的血清补体对大肠杆菌的清除能力最高。关键词:大肠杆菌;免疫;抗体;补体;细菌计数中图分类号:阳52.4文献标识码:B现代免疫学认为细菌性疫苗免疫动物产生抗体后，当细菌再次

3、侵染机体时，抗体与细菌的结合，可以出现凝集或鞭毛制动现象，但一般而言对细菌的活动只有微弱的影响，甚至没有影响〔’〕。而细菌的清除，则主要是靠补体的溶解或吞嗜细胞的吞嗜作用，因此动物补体在获得性免疫中也具有举足轻重的作用。细菌性疫苗免疫动物产生抗体后，当同种病原菌再次侵人机体时，机体内补体活性的高低是能否清除病原菌保护动物的关键，本试验通过细菌计数，观察不同动物的血清补体在存在抗体情况下对细菌的清除能力是否存在差异。1材料和方法1.1材料078大肠杆菌:由本实验室保存。鸡大肠杆菌阳性血清:由山东农业大学兽医制品厂提供

4、;SpF鸡血清:由山东省家禽研究所SPF鸡场提供;兔血清、猪血清、牛血清、羊血清:由山东农业大学动物实习基地提供;豚鼠血清:山东米歇尔生物制品有限公司提供。1日龄褐蛋用公雏:购自泰安市东岳种鸡场。1.2方法1.2.1大肠杆菌抗体的制备1.2.1.1抗原的制备:将保存的078大肠杆菌用营养琼脂培养活化，然后取活化的菌种接种营养肉汤，37℃培养18一抖卜后，ZJX)rl而n离心10nlin，弃上清，用灭菌生理盐水洗涤菌体，加田“而n离心10min，弃上清，共洗涤3次。然后用麦氏比浊管法测定其含菌数。加人浓度为0.3%的

5、甲醛溶液灭活对h，经无菌检验合格后，作为制苗收稿日期:么刃6朋一20第6期马雪云，等:不同动物血清补体对大肠杆菌的杀灭效果103用菌液;取适量的蜂胶磨碎，加适量95%的酒精溶解，配成刃n喇mL的蜂胶溶液，此即为蜂胶佐剂;将蜂胶佐剂按0.2%量加人灭活菌液，充分混合，制成黄色微带豁性的大肠杆菌灭活疫苗悬液(菌体含量为1.0x1010个/mL)。1.2.1.2大肠杆菌灭活苗的检验:无菌检验，取适量的大肠杆菌灭活苗均匀涂布于营养琼脂平板上，37℃培养48h，观察有无细菌生长。安全性检验:取ro只1日龄海蓝褐雏鸡，分别于腹

6、腔注射菌苗0.lmL，观察1周内的生长情况。1.2.1.3免疫:取10日龄海蓝褐蛋用公雏10只，颈部皮下注射0.51Yllj只，分别在20日龄和30日龄时加强免疫一次，40日龄时，翅静脉采血，分离血清，平板凝集法测定血清抗体的效价。当抗血清的效价达到1:犯时，对10只鸡分别进行心脏采血，分离血清，备用。1.2.2不同动物补体对大肠杆菌的杀灭1.2.2.1大肠杆菌抗血清中补体的灭活:将水浴锅的温度调至印℃，取smL从1.2.1中得到的鸡抗大肠杆菌血清加人一支101nL的试管中，将试管放人水浴锅中，印℃灭活玺b五n。鸡

7、血清补体灭活的检验:取1%的绵羊红细胞与4单位的溶血素充分混合，于37℃水浴反应叨而n后，取此反应悬液岌卜L于V型微量反应凝集板上的一个孔中，加人灭活后的鸡血清反卜L，充分混匀，置37℃水浴反应刃nlin，观察，未见有溶血现象视为鸡的抗血清中的补体完全灭活，若有溶血现象，则应继续灭活。1.2.2.2不同动物血清补体与大肠杆菌抗原抗体复合物反应:将活化后的印8大肠杆菌用灭菌生理盐水调节其浓度为1俨个/mL，取7支10mL的试管，并编号，在每个试管中加人大肠杆菌菌液0.smL，同时加人灭活补体的抗血清0.smL，充分混

8、合后，于37℃条件下水浴叨而n，然后分别在1一6号管中加人新鲜的鸡血清、兔血清、猪血清、牛血清、羊血清和豚鼠血清0.smL，第7管中加人0.smL灭菌生理盐水，充分混合，再于37℃条件下水浴义b五n，然后，用平板菌落计数法检验每个试管中的细菌数。1.2.3不同动物血清补体活性的侧定:微量板溶血法[2]。2结果2.1大肠杆菌抗体的制备2.1.1抗原无菌检验和安