组织工程骨软骨仿生设计与初步构建

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1、第三军医大学博士学位论文组织工程骨软骨仿生设计与初步构建姓名：王富友申请学位级别：博士专业：外科学（骨科）指导教师：杨柳20080501第三军医大学博士学位论文组织工程骨软骨仿生设计与初步构建摘要由创伤或骨病所致关节骨软骨缺损临床常见，主要表现为顽固性疼痛、关节运动功能受限，严重影响患者生活质量，已成为目前肢体残障的主要原因之一。美国发病率为1．5‰～3‰，我国约为美国的5～6倍，且随着中老年人群比例的增加呈逐年上升趋势。由于软骨没有神经、血管及淋巴系统，自身修复能力非常有限，直径>2mm的软骨缺损几乎不能完

2、全修复，如果合并软骨下骨缺损治疗更为困难。现有临床治疗措施均存在明显缺陷，其中保守治疗与关节清理术只能暂时缓解疼痛，不能阻止病程的发展；自体骨软骨移植术人为造成供区缺损，且来源有限，难以修复面积较大的缺损；异体骨软骨移植术存在免疫排斥反应及传播疾病的可能；关节融合术改变了关节原有的解剖结构，丧失了关节的运动功能，患者难以接受；人工关节置换术费用昂贵、并发症较多、翻修率较高，且经济负担较重，特别是对年轻患者的身心健康影响极大。快速发展的组织工程技术，尤其是单一组织工程骨和组织工程软骨构建技术的日趋成熟，为关节骨

3、软骨缺损的再生修复提供了新思路和新技术。国内外对组织工程骨软骨复合组织的构建研究比较深入，从“分层构建”的可行性初探到“一体构建"的动物实验研究取得了阶段性成果，然而目前尚存在缺损区修复组织质量缺陷、与宿主界面整合欠佳及缺乏相应力学功能等主要问题。组织工程学是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物正常及病理两种状态下组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维持和促进人体各种组织或器官损伤后功能和形态生物替代物的科学。与单一的软骨组织和骨组织比，骨软骨复合组织是成分与结构较为复杂的功能器官

4、。因此，我们推测目前制备的组织工程骨软骨之所以存在上述问题，主要原因是：(1)缺乏对人体关节部位正常骨软骨复合组织的基本成分、形态结构、生理功能及其生理微环境深入认识，忽视了对关节软骨与软骨下骨之间的界面连接结构一一钙化软骨层的构建；(2)所选用的生物材料与宿主成分存在较大的差异，植入体内容易产生免疫排斥反应，或在降解过程中造成生理微环境的改变，不利于植入细胞的增殖与分化；(3)理想的构建策略，不是将再造的软骨与骨组织简单地缝合或第三军医大学博士学位论文粘合在一起，而应以其正常形态结构为依据，采用仿生生物材料

5、构建与宿主结构相似的一体化组织工程骨软骨。针对上述原因，本研究首先采用组织形态学相关技术与方法，对人体正常膝关节骨软骨复合组织，尤其是其功能界面一一钙化软骨层的形态结构、主要组分进行了深入研究；然后以所获得的研究结果为依据，利用仿生学原理，选用胶原蛋白、壳聚糖和羟基磷灰石为组织工程骨软骨支架材料；应用壳聚糖一一胶原蛋白嫁接技术、羟基磷灰石一一胶原蛋白矿化技术、以及喷雾干燥技术等方法对仿生原材料进行调控与修饰；通过体外细胞材料共培养实验、兔背部皮下植入实验，证实所研制的三种仿生生物材料均具有良好生物相容性与安全

6、性；最后建立兔膝关节股骨滑车面骨软骨缺损模型，采用体内一体化构建策略，将体外制备好的细胞材料复合体分层植入体内，研究发现由于软骨层材料固定不佳，导致修复结果不理想。因此，又采用体外一体化构建策略，应用计算机辅助下的三维打印技术对组织工程骨软骨一体仿生支架进行了初步研制。第一部分人体正常关节骨软骨形态结构观察与组分分析本部分研究，以人体膝关节正常骨软骨复合组织为实验材料，采用组织形态学相关技术与方法，对骨软骨复合组织的形态结构、组成成分以及各层组织间的界面连接方式进行了探索，为组织工程骨软骨复合组织的仿生构建提

7、供理论依据。一、实验方法1．人体正常关节骨软骨形态结构观察(1)采用组织切片技术，番红O／固绿染色、冯库萨染色等方法观察骨软骨复合组织的形态结构。(2)采用扫描电镜技术、连续切片组织三维重建技术观察骨软骨各层组织间界面连接方式。2．人体正常关节骨软骨组分分析(1)采用免疫组织化学与氨基酸分析技术对骨软骨复合组织中胶原蛋白进行定性、定量分析。(2)采用x。射线衍射技术对骨软骨复合组织中羟基磷灰石进行定性、定量分析。二、实验结果1．成人关节骨软骨自关节面向深部依次分为透明软骨层、钙化软骨层和软骨下骨三层结构。透明

8、软骨层厚约3姗左右，钙化层厚度仅为几微米至300多微米，其上界面以波浪状的潮线结构与透明软骨层紧密连接，其下界面以凸凹不平的梳齿状结构与软骨下骨相互锚合。2．透明软骨主要由II型胶原蛋白组成，占组织干重的61．39％士0．38％，余为蛋白多第三军医大学博士学位论文糖；钙化软骨层主要由II型胶原蛋白和羟基磷灰石组成，分别占组织干重的20．16士0．96％和65．09％圪．31％：软骨下骨主要由I型胶原