SNT2777-2011输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的巢式RT-PCR检测方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７７７—２０１１输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的巢式犚犜犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犲狆犻犱犲犿犻犮犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊（犈犎犉犞）犻狀犻犿狆狅狉狋犲犱狉狅犱犲狀狋狊—犕犲狋犺狅犱狅犳狀犲狊狋犲犱犚犜犘犆犚２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７７７—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出

2、并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑剑宁、裘炯良、胡群、吴薇、黄彤文、杨苹、王燕。Ⅰ犛犖／犜２７７７—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的巢式犚犜犘犆犚检测方法１范围本标准规定了国境口岸输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的生物安全要求、检测方法、结果的报告、阳性结果处置。本标准适用于出入境检验检疫机构对输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的检测，对口岸发现的啮齿动物及食虫目动物中的普通鼩?、大

3、麝鼩、臭鼩等检测流行性出血热病毒也可参照执行。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１啮齿动物狉狅犱犲狀狋狊哺乳纲中种类最多，分布最广的一类动物，包括啮齿目和兔形目。一般体型较小，数量多，繁殖快，适应力强，其中多数可携带流行性出血热病毒。３．２输入性啮齿动物犻犿狆狅狉狋犲犱狉狅犱犲狀狋狊通

4、过入境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包携带入境的啮齿动物。３．３流行性出血热犲狆犻犱犲犿犻犮犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉；犈犎犉由啮齿动物携带的汉坦病毒引起的伴有肾综合征的一类出血热的综合名称，主要包括姬鼠型及家鼠型流行性出血热及流行性肾病。３．４流行性出血热病毒犲狆犻犱犲犿犻犮犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊；犈犎犉犞属布尼亚病毒科，汉坦病毒属，是一组单股负链ＲＮＡ病毒，由大（Ｌ）、中（Ｍ）、小（Ｓ）３个片段组成，分别编码病毒的ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ多聚酶（Ｌ）、外膜蛋白Ｇ１、Ｇ２和核衣壳蛋白（Ｎ），为流行性出血热的病原体，常见

5、有汉滩病毒型和汉城病毒型。４生物安全要求实验室操作应在生物安全Ⅱ级（ＢＳＬ２或ＡＢＳＬ２）实验室中进行，实验完毕后对实验中所用物品及实验台进行灭菌消毒，以保证实验室工作人员及实验室安全。１犛犖／犜２７７７—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售５巢式犚犜犘犆犚５．１器材与试剂５．１．１器材ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、电子分析天平、紫外观察灯、恒温培养箱、普通冰箱、超低温冰箱（－８０℃）、组织研磨器、外排式生物安全柜、液氮罐、离心机和离心管、常温摇床、ＰＣＲ管、剪刀、镊子。５．１．２试剂５．１．２．１水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一

6、级水的规格。用于ＰＣＲ（包括核酸抽提）时所用的水应是无ＲＮＡ酶的水。５．１．２．２犜犪狇犇犖犃聚合酶浓度为５Ｕ／μＬ，－２０℃保存。５．１．２．３犃犕犞逆转录酶浓度为１０Ｕ／μＬ，－２０℃保存。５．１．２．４犚犖犪狊犲抑制剂（犚犖犪狊犻狀）－２０℃保存。５．１．２．５犱犖犜犘含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ和ｄＴＴＰ，浓度均为１０ｍｍｏｌ／Ｌ。５．１．２．６２０μ犿狅犾／犔引物５．１．２．６．１逆转录引物序列５’ＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＣＴＣＣ３’５．１．２．６．２通用外引物序列５’ＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＩＴＡＹＡＴＣＹＴＩＡＣＡＡＴＧＴＧＧ

7、３’５’ＧＴＡＣＡＩＣＣＴＧＴＲＣＣＩＡＣＣＣＣ３’５．１．２．６．３汉滩病毒引物序列５’ＧＡＡＴＣＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣ３’５’ＧＧＡＴＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＣ３’５．１．２．６．４汉城病毒引物序列５’ＧＴＧＧＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴ３’５’ＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＴＧＣＡＴＧ３’５．１．２．７无水乙醇分析纯，无ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶，使用前预冷到－２０℃。２犛犖／犜２７７７—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售５．１．２．８病毒标准株流行性出血热病毒标准株（由浙江省疾

8、病预防控制中心提供）１）。５．１．３试剂配制５．１．３．１变性液双蒸水５８．６ｍＬ、异硫氰酸胍５０．０ｇ、０．７５ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠（ｐＨ７．０）１７．６ｍＬ、１０