SNT2754.13-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法创伤弧菌.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７５４．１３—２０１１出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第１３部分：创伤弧菌犔狅狅狆犿犲犱犻犪狋犲犱犻狊狅狋犺犲狉犿犪犾犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱—犘犪狉狋１３：犞犻犫狉犻狅狏狌犾狀犻犳犻犮狌狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７５４．１３—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售前

2、言ＳＮ／Ｔ２７５４《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法》共分为１５个部分：———第１部分：金黄色葡萄球菌；———第２部分：大肠杆菌Ｏ１５７；———第３部分：志贺氏菌；———第４部分：单核细胞增生李斯特菌；———第５部分：副溶血性弧菌；———第６部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；———第７部分：空肠弯曲菌；———第８部分：肺炎克雷伯氏菌；———第９部分：溶血性链球菌；———第１０部分：产气荚膜梭菌；———第１１部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；———第１２部分：溶藻弧菌；———第１３部分：创伤弧菌；———第１

3、４部分：假结核耶尔森氏菌；———第１５部分：阪崎肠杆菌。本部分为ＳＮ／Ｔ２７５４的第１３部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：曾静、魏

4、海燕、田青玫、郑文杰、易敏英、冯家望、李志勇、曾宪东、王志强、曹以诚、高东微。Ⅰ犛犖／犜２７５４．１３—２０１１版权所有·禁止翻制、电子发售出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第１３部分：创伤弧菌１范围ＳＮ／Ｔ２７５４的本部分规定了检测出口食品中创伤弧菌的环介导恒温核酸扩增（ＬＡＭＰ）法。本部分适用于出口食品中创伤弧菌的筛选检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件

5、。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３实验室质量控制规范食品分子生物学检测ＮＭＫＬＮｏ．１５６食品中致病性弧菌的检测和计数３生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测创伤弧菌，所有培养物和废弃物应按照ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。４防污染措施防止污染措施应符合ＧＢ／Ｔ２７４０３的规定。５缩略语下列缩略语适用于本文件。Ｂｅｔａｉｎｅ：甜菜碱犅狊狋酶［犅狊狋ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔ）］：犅狊狋ＤＮＡ聚

6、合酶（大片段）ＣＴ（ｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎ）：霍乱毒素ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核苷三磷酸ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：环介导恒温扩增ＴｒｉｔｏｎＸ１００：聚乙二醇辛基苯基醚犞狏犺Ａ：ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ溶细胞素基因１犛犖／犜２７５４．１３—２０１１版权

7、所有·禁止翻制、电子发售６技术概要根据创伤弧菌属特有的靶序列基因（参见附录Ａ）设计的特异性内引物、外引物和环状引物各一对，特异性识别靶序列上的八个独立区域，利用犅狊狋酶启动循环链置换反应，在犞狏犺Ａ基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环ＤＮＡ混合物；从ｄＮＴＰ析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Ｍｇ２＋结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。７试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一

8、级水的要求。７．１引物：根据创伤弧菌属特有的靶序列设计一套特异性引物，包括外引物１，外引物２，内引物１，内引物２和环状引物１，环状引物２。外引物扩增片段长度：１８０ｂｐ。外引物１（Ｆ３，５’３’）：ＧＣＧＴＣＡＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴ外引物２（Ｂ３，５’３’）：ＴＧＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧ内引物１（ＦＩＰ，５’３’）：ＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＧＴＡＡＡＧＣＧＧＡＣｔｔｔｔＧ