SNT2733-2010小反刍兽疫检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"##"!$%$小反刍兽疫检疫技术规范$%&'&()*(+,'-)-.&/0-',+1)+2+1,+)*)1'%3*(&()1!$%$4%%4$%发布!$%%4$&4$%实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７３３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、

2、中华人民共和国西藏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：董俊、杨建民、严树发、杨云庆、艾军、叶玲玲、徐自忠、花群义、周晓黎。Ⅰ犛犖／犜２７３３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售小反刍兽疫检疫技术规范１范围本标准规定了小反刍兽疫的病原分离及鉴定、聚合酶链式反应、血清抗体中和试验、酶联免疫吸附试验检测方法。本标准适用于小反刍兽疫的诊断和流行病学调查。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１

3、８０８８出入境动物检疫采样３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１小反刍兽疫狆犲狊狋犲犱犲狊狆犲狋犻狋狊狉狌犿犻狀犪狀狋狊；犘犘犚由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。４疾病简介参见附录Ａ。５现场检验检疫及采样５．１现场检验检疫：逐头进行临床检查，根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。５．２采样：按ＧＢ／Ｔ１８０８８规定，逐头进行采样，并按规定填写《送样单》送实验室。６诊断方法６．１病毒分离、鉴定（生物安全三级实验室进行）６．１．１试剂和材料６．１．１．１小反

4、刍兽疫标准阳性、阴性血清。６．１．１．２细胞：羊肾原代细胞或非洲绿猴肾细胞（ＶＥＲＯ）。６．１．１．３培养液：１９９或ＭＥＭ培养基中加１０％犊牛血清（经５６℃３０ｍｉｎ灭能），含青霉素２００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２００ＩＵ／ｍＬ。１犛犖／犜２７３３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售６．１．１．４维持液：１９９或ＭＥＭ培养基中加２％的犊牛血清（经５６℃３０ｍｉｎ灭能），含青霉素２００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２００ＩＵ／ｍＬ。６．１．１．５细胞分散液：配制见附录Ｂ。６．１．１．６犊牛血清：不含细菌、支原体，５６℃灭能３０ｍｉｎ。６．１．

5、１．７ＰＢＳ缓冲液：配制见附录Ｂ。６．１．２设备６．１．２．１超净工作台。６．１．２．２乳钵或组织捣碎器。６．１．２．３倒置显微镜。６．１．２．４二氧化碳培养箱。６．１．２．５可调单头微量移液器（０．５μＬ～１０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ）。６．１．２．６冷冻微量离心机。６．１．２．７２４孔、９６孔细胞培养板。６．１．２．８微型振荡器。６．１．３样品采集６．１．３．１活体动物采集眼睑下结膜分泌物和鼻腔分泌物、颊部及直肠粘膜病料拭子。采集全血时加肝素抗凝剂。死亡动物，解剖尸体２头～３头，取淋巴结，特别是

6、肠系膜和支气管淋巴结，脾和肠粘膜也应采集。采集后立即密封、冷藏送检或置含抗生素的ＰＢＳ缓冲液中－２０℃密封保存。编号和作好记录。６．１．３．２眼睑下结膜分泌物和鼻腔、颊部及直肠粘膜病料拭子：用拭子采取分泌物，拭子一并放入盛有１．０ｍＬ含抗生素的ＰＢＳ缓冲液的１．５ｍＬ离心管中。编号，冷藏送检或低温密封保存。６．１．３．３血液：无菌、肝素抗凝采集，密封、编号后保存于４℃送检。６．１．３．４组织脏器：无菌采集待检样品，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，密封、冷藏送检或低温密封保存。６．１．３．５精液：抽检的精液样品应不少于１ｍ

7、Ｌ，冻精样品每头每批次取样３管～５管，编号，置冰盒送检。６．１．４样品贮运样品采集后，按批次放入密闭的采样袋内，低温、密封，送实验室。６．１．５样品处理６．１．５．１眼睑下结膜分泌物和鼻腔分泌物、颊部及直肠粘膜病料拭子收到棉拭子样品后，５００溶解，样品振荡混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，经μＬＰＢＳ４℃１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液作为组织培养的接种材料，编号备用。６．１．５．２组织脏器取待检样品２．０ｇ于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加１０ｍＬ细胞维持液混匀，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，

8、取上清液转入无菌的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。６．１．５．３精液用维持液将精液作１∶５稀释，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液作为接种分离病毒的材料。２犛犖／犜２７３３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售６．１．５．４血液样品４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉ