SNT2531-2010贝类和水样中札如病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５３１—２０１０贝类和水样中札如病毒检测方法普通犚犜犘犆犚方法和实时荧光犚犜犘犆犚方法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犛犪狆狅狏犻狉狌狊犻狀狊犺犲犾犾犳犻狊犺犪狀犱狑犪狋犲狉—犆狅狀狏犲狀狋犻狅狀犪犾犚犜犘犆犚犪狀犱狉犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２５３１—２０１０前言本标准附录Ａ为规范性附录，附录Ｂ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华

2、人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：潘良文、卢钟山、邓恬宁、吕蓉、张舒亚、李想、刘月明、高琴。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２５３１—２０１０贝类和水样中札如病毒检测方法普通犚犜犘犆犚方法和实时荧光犚犜犘犆犚方法１范围本标准规定了贝类和水样中札如病毒普通ＲＴＰＣＲ方法和实时荧光ＲＴＰＣＲ方法。本标准适用于贝类和水样中札如病毒的定性检测。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的

3、修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求３术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１犆狋值犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。３．２质粒标准分子狆犾犪狊犿犻犱狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿狅犾犲犮狌犾犲一种包含病毒特异性ｃＤＮＡ片段的重组质粒分子，可作为病毒ＰＣＲ检测中的阳性对照。４方法提要用合适的裂解液（如Ｔｒｉｒｅａ

4、ｇｅｎｔ）提取贝类样品中病毒ＲＮＡ，并根据札如病毒ＲＮＡ３’末端含有Ｐｏｌｙ（Ａ）的结构，用连接Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５的磁珠特异性吸附札如病毒ＲＮＡ进行纯化。对水样中的病毒进行富集后，采用合适的方法提取和纯化病毒ＲＮＡ。利用普通ＲＴＰＣＲ或实时荧光ＲＴＰＣＲ方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分子（每个质粒分子包含１拷贝扩增片段），确定札如病毒普通ＲＴＰＣＲ体系检测下限为１００拷贝，实时荧光ＲＴＰＣＲ体系检测下限均为１０拷贝。５试剂所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。５．１阳性标本：

5、札如病毒，－８０℃冰箱保存；或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子，－２０℃冰箱保存。５．２甘氨酸缓冲液：见附录Ａ．１．１。５．３ＰＥＧ８０００溶液：见附录Ａ．１．２。５．４裂解液：Ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ或其他等效裂解液（如：ＴＲＩｚｏｌ）。５．５Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５磁珠：Ｄｙｎａｂｅａｄｓｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５或等效品。５．６超纯水（无ＲＮａｓｅ和ＤＮａｓｅ污染）：见附录Ａ．２．３。５．７７５％乙醇：见附录Ａ．２．４。１犛犖／犜２５３１—２０１０５．８三氯甲烷。５．９异丙醇。５．１０１×ＲＮＡ吸附缓冲液：见附录Ａ．２

6、．５。５．１１２×ＲＮＡ吸附缓冲液：见附录Ａ．２．６。５．１２漂洗缓冲液：见附录Ａ．２．７。５．１３ＴａＫａＲａＲＮＡＰＣＲＫｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ３．０，ＴａＫａＲａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＲＲ０１９Ａ。ＴＭ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）及配套ＲＯＸ荧光校正试剂（５０×），ＴａＫａＲａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５．１４ＰｒｅｍｉｘＥｘ犜犪狇ＤＲＲ０３９Ａ。５．１５引物和探针：根据表１和表２的序列合成引物和探针，加超纯水（无ＲＮａｓｅ和ＤＮａｓｅ污染）配制成１０μｍｏｌ／Ｌ储备液。表１札如病毒普通犚犜犘犆犚检测引物名称序列扩增片段大小

7、／ｂｐＳＬＶ５３１７５’ＣＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＲＡＷＧＣＢＴＧＧＴＴ３’４３４ＳＬＶ５７４９５’ＣＧＧＲＣＹＴＣＡＡＡＶＳＴＡＣＣＢＣＣＣＣＡ３’注：Ｒ：Ａ／Ｇ；Ｗ：Ａ／Ｔ；Ｂ：Ｇ／Ｔ／Ｃ；Ｙ：Ｃ／Ｔ；Ｖ：Ｇ／Ａ／Ｃ；Ｓ：Ｇ／Ｃ。表２札如病毒实时荧光犚犜犘犆犚检测引物和探针引物和探针名称序列ＳａＶ１２４Ｆ５’ＧＡＹＣＡＳＧＣＴＣＴＣＧＣＹＡＣＣＴＡＣ３’ＳａＶ１Ｆ５’ＴＴＧＧＣＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣ３’引物ＳａＶ５Ｆ５’ＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＴＧＣＴＡＣ３’ＳａＶ１２４５Ｒ５’Ｃ

8、ＣＣＴＣＣＡＴＹＴＣＡＡＡＣＡＣＴＡ３’ＳａＶ１２４ＴＰ５’ＦＡＭＣＣＲＣＣＴＡＴＲＡＡＣＣＡＭＧＢ３’探针ＳａＶ５ＴＰ５’ＦＡＭＴＧＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＣＡＭＧＢ３’注１：Ｙ：Ｃ／Ｔ；Ｓ：Ｇ／Ｃ；Ｒ：Ａ／Ｇ。注２：探针也可选用具有与ＦＡＭ和ＭＧＢ荧光基团相同检测效果的其他合适的荧