SNT2530-2010贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５３０—２０１０贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒检测方法普通犚犜犘犆犚方法和实时荧光犚犜犘犆犚方法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狆狅犾犻狅狏犻狉狌狊犲狊犻狀狊犺犲犾犾犳犻狊犺，犳狉狌犻狋，狏犲犵犲狋犪犫犾犲犪狀犱狑犪狋犲狉—犆狅狀狏犲狀狋犻狅狀犪犾犚犜犘犆犚犪狀犱狉犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒检测方

2、法普通犚犜犘犆犚方法和实时荧光犚犜犘犆犚方法ＳＮ／Ｔ２５３０—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１字数２５千字２０１０年５月第一版２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８６９定价１８．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２５３０—２０１０前言本标准中附录Ａ为规范性附录，附录

3、Ｂ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李想、潘良文、卢钟山、吕蓉、张舒亚、黄一、刘月明、高琴。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５３０—２０１０贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒检测方法普通犚犜犘犆犚方法和实时荧光犚犜犘犆犚方法１范围本标准规定了贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒普通ＲＴＰＣＲ方法和实时荧光ＲＴＰＣＲ方法。本标准适用于贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒的定性检测。２规范性引用

4、文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求３术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１犆狋值犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。３．２质粒标准分子狆犾犪狊犿犻犱狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿狅犾犲犮狌犾犲一种包含病毒特

5、异性ｃＤＮＡ片段的重组质粒分子，可作为病毒ＰＣＲ检测中的阳性对照。４方法提要用合适的裂解液（如Ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ）提取贝类样品中病毒ＲＮＡ，并根据脊髓灰质炎病毒ＲＮＡ３’末端含有Ｐｏｌｙ（Ａ）的结构，用连接Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５的磁珠特异性吸附脊髓灰质炎病毒ＲＮＡ进行纯化。对水样中的病毒进行富集后，采用合适的方法提取和纯化病毒ＲＮＡ。用合适的缓冲液洗脱果蔬样品表面病毒后，对病毒进行富集，并采用合适的方法提取纯化病毒ＲＮＡ。利用普通ＲＴＰＣＲ或实时荧光ＲＴＰＣＲ方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分

6、子（每个质粒分子包含１拷贝扩增片段），确定适于Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒检测的普通ＲＴＰＣＲ体系检测下限均为５０拷贝，实时荧光ＲＴＰＣＲ体系检测下限均为２拷贝。５试剂所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。５．１阳性标本：脊髓灰质炎病毒，－８０℃冰箱保存；或含脊髓灰质炎病毒检测目的片段的质粒标准分子，－２０℃冰箱保存。５．２甘氨酸缓冲液：见Ａ．１．１。５．３ＰＥＧ８０００溶液：见Ａ．１．２。５．４ＰＢＳ缓冲液：见Ａ．１．３。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载

7、犛犖／犜２５３０—２０１０５．５裂解液：Ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ或其他等效裂解液（如：ＴＲＩｚｏｌ）。５．６Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５磁珠：Ｄｙｎａｂｅａｄｓｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５或等效品。５．７超纯水（无ＲＮａｓｅ和ＤＮａｓｅ污染）：见Ａ．２．３。５．８７５％乙醇：见Ａ．２．４。５．９三氯甲烷。５．１０异丙醇。５．１１１×ＲＮＡ吸附缓冲液：见Ａ．２．５。５．１２２×ＲＮＡ吸附缓冲液：见Ａ．２．６。５．１３漂洗缓冲液：见Ａ．２．７。５．１４ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ，ＴａＫａＲａ，Ｃａ

8、ｔ．Ｎｏ．ＤＲＲ０３７Ｓ。５．１５Ｂｌｅｎｄ犜犪狇ＰｌｕｓＤＮＡ聚合酶及配套缓冲液和ｄＮＴＰｓ，ＴｏＹｏＢｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＴＱ２０１。５．１６ＰｒｅｍｉｘＥｘ犜犪狇ＴＭ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）及配套ＲＯＸ荧光校正试剂（５０×），ＴａＫａＲａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＲＲ０３９Ａ。５．１７引物和探针：根据表１和表２的序列合成引物和探针，引物和探针加超纯水（无ＲＮａｓｅ和ＤＮａｓｅ污染）分别配制成１０μｍｏｌ／Ｌ和５μｍ