SNT2452-2010绵羊痘和山羊痘检疫技术规范.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４５２—２０１０绵羊痘和山羊痘检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狋犺犲狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉狊犺犲犲狆狆狅狓犪狀犱犵狅犪狋狆狅狓２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２４５２—２０１０前言本标准参照ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（２００８年）中第２．７．１４章制定。本标准的附录Ａ、附录Ｂ、附录Ｃ和附录Ｄ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫

2、科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王海艳、刘中学、赵林立、刘虹、敖威华、高志强、季新成、薛强、乔彩霞、任立新。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４５２—２０１０绵羊痘和山羊痘检疫技术规范１范围本标准规定了绵羊痘和山羊痘流行病学调查、临床症状与病理学观察、实验室检测等技术内容。本标准适用于绵羊痘和山羊痘的诊断、检疫。２设备和材料２．１恒温培养箱、恒温水浴箱、冰箱。２．２生物显微镜、透射电子显微镜。２．３高压灭菌器、高速冷冻离心机。２．４单道微量加样器：１μＬ～１０μＬ，１００μＬ，２００

3、μＬ，１０００μＬ。２。２．５细胞培养瓶：２５ｃｍ２．６酶标仪、蛋白凝胶电泳仪、电转印仪。３培养基和试剂３．１Ｈａｎｋ’ｓ液：见附录Ａ第Ａ．１章。３．２０．２５％胰酶消化液：见附录Ａ第Ａ．２章。３．３ＭＥＭ细胞培养液：具体配制方法按厂家规定的程序进行，用０．２μｍ的滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，４℃保存备用。３．４ＥＤＴＡ胰蛋白酶分散液：见附录Ａ第Ａ．３章。３．５抗生素溶液：见附录Ａ第Ａ．４章。３．６绵羊痘和山羊痘抗原及相应的标准阴性血清和标准阳性血清。３．７青霉素、链霉素、制霉菌素（或两性霉素）、新霉素。３．８ＰＢＳ溶液：见附录Ａ第Ａ．５章。３．９１０×Ｔｒｉｓ甘氨酸电泳缓冲

4、溶液（ｐＨ８．３）：见附录Ａ第Ａ．６章。３．１０转移缓冲溶液：见附录Ａ第Ａ．７章。３．１１硝酸纤维素膜、胎牛血清、蛋白质分子量Ｍａｒｋｅｒ、牛血清白蛋白、辣根过氧化物酶标记的兔（或小鼠）抗羊ＩｇＧ。３．１２１２％分离胶：见附录第Ａ．８章。３．１３５％的积层胶：见附录Ａ第Ａ．９章。３．１４１×ＳＤＳ凝胶上样缓冲液：见附录Ａ第Ａ．１０章。３．１５考马斯亮蓝染色液：见附录Ａ第Ａ．１１章。３．１６１％磷钨酸溶液（ｐＨ７．２）：见附录Ａ第Ａ．１２章。３．１７琼脂板：见附录Ａ第Ａ．１３章。３．１８底物溶液：见附录Ａ第Ａ．１４章。３．１９苏木素染色液：见附录Ａ第Ａ．１５章。３．２００．５％伊红

5、染色液：见附录Ａ第Ａ．１６章。３．２１无水乙醇、二甲苯。３．２２石蜡：熔点分别为５２℃～５４℃，５４℃～５６℃，５６℃～５８℃。３．２３绵羊羔睾丸细胞的制备：见附录Ｂ。１犛犖／犜２４５２—２０１０４临床症状见附录Ｃ。５检测方法５．１病毒电镜观察５．１．１将活体或死后的皮肤丘疹、肺部的病灶或淋巴结用灭菌剪刀和镊子切碎后，放入灭菌的研钵内加入灭菌砂后进行研磨。研碎后加入等体积含抗生素（青霉素［１０００单位／ｍＬ］，链霉素［１ｍｇ／ｍＬ］，制霉菌素［１００单位／ｍＬ］或两性霉素［２．５μｇ／ｍＬ］，新霉素［２００单位／ｍＬ］）的ＰＢＳ溶液制成样品悬液。将样品悬液反复冻融三次后，于６００

6、犵离心１０ｍｉｎ，取上清液保存备用。５．１．２取一滴上清液置于载玻片上，将４００目碳网膜漂浮于液滴上１ｍｉｎ，再置于一滴ＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液中浸泡２０ｓ，然后用一滴１％的磷钨酸溶液（ｐＨ７．２）染色１０ｓ。取出碳网膜，用滤纸吸干膜上液体，待自然干燥后镜检。５．１．３结果判定：羊痘病毒颗粒应呈砖形，其表面有短管状物覆盖，大小约２９０ｎｍ×２７０ｎｍ。有些病毒粒子周围有寄主细胞膜包裹。５．２包涵体检查５．２．１病料采集采集病变组织用于组织学检测，病变组织周围应该连带一些健康组织，采集后的组织立即放入１０％的福尔马林溶液中固定２４ｈ。５．２．２切片制备将用福尔马林溶液固定的组织材料

7、按照常规石蜡切片的制备方法制备切片。制备方法见附录Ｄ中第Ｄ．１章。www.bzfxw.com５．２．３染色用ＨＥ染色法进行染色，ＨＥ染色方法见附录Ｄ中第Ｄ．２章。５．２．４结果判定染色后的切片置光学显微镜下观察。羊痘感染病料的组织细胞，细胞质内应有不定形的噬酸性包涵体，细胞核内有空泡。５．３琼脂扩散试验５．３．１操作方法５．３．１．１被检抗原悬液的制备将按照５．１．１的方法制备的样品悬液接种绵羊睾丸单层细胞。接种时，取覆盖面达９０％的绵羊睾丸细胞单层，弃去培养液，每瓶接种１ｍ