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1、T载体-B载体与PCR克隆困扰盘古基因李万波PCR技术给基因工程带来了巨大的变革，生物学家可以配合DNA内切酶随意放大、克隆基因。一、T-载体与B-载体PCR产物的克隆技术也得到了长足发展，T/A克隆载体（简称“T载体”）就是上世纪末发展起来的。Taq酶是第一个被克隆的嗜热菌DNA聚合酶，由于发现了Taq酶具有不依赖DNA模板的核苷酸末端转移酶活性，能够给双链DNA的3’-末端添加1个碱基，所以T/A克隆技术应运而生。Taq酶在dNTP俱全的情况下，优先添加1个A碱基（3’-AProtruding）,当只有其它某个碱基时，她就退而求其次，也能加上1个
2、其它碱基，比如“dTTP”。PCR产物的平端连接效率本来很低，这是因为常规合成的寡核苷酸引物5’-端不带磷酸，T4DNA连接酶只能将DNA链的3’-OH和另一DNA链的5’-P(磷酸基团)相连。DNA内切酶切开的平末端5’带有磷酸基，只有这条链能与PCR产物的3’-OH发生连接反应，另一条链没有粘性。T/A克隆时也一样，只能连接单链，另一条链上的缺口（Nick）需要受体菌（HostBacteria）体内的激酶和连接酶帮助修补，才能成为完整的环状质粒，完成滚环复制，抵抗筛选压（抗生素毒性）。所以，如果质粒转化感受态菌后的37℃温育不够1小时，菌落数是会
3、减少的。上世纪80年代，拓扑异构酶1B的发现使得PCR产物的平端克隆技术（Blunt-endcloningvector,B-载体）取得了巨大改进。拓扑异构载体对平末端的连接速度和效率至今无可匹敌。这类载体有盘古基因的pACK4a系列、原locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfe
4、wbayonets,duetomissedfatal,whennightcame核表达载体Topoied系列、哺乳类载体Topoied系列，此外还有Invitrogen和全式金的相应载体。该类载体由于TopoisomeraseIb的微弱的记忆功能，需要PCR引物的5’第一个碱基尽量与载体处理前切除的5’端碱基相同，这样才能获得近乎100%的克隆率。通常由于受PCR退火温度的限制，引物设计时5’-添加1个“A“碱基是较少影响引物的Tm值的。5’端添加G或C则会显著增加Tm。上世纪与TOPO载体同时发展起来的还有“同源重组“克隆技术，由于其需要PCR引物
5、的5’端附加较长的同源尾巴（与模板不配对的），一直不能被广泛接受，因为长达15个以上附加碱基的引物常常会使PCR困难（增加非特异性扩增的机会，分散了PCR酶精力，使主条带变弱）。但该技术在DNA序列拼接和点突变方面有其长处。二、PCR酶PCR酶就是DNA聚合酶（DNAPolymerase）。PCR酶按其掺入错误几率来分，有高保真酶和Taq酶。高保真酶的ErrorRate在1/100万，即每聚合1百万个碱基时，可能出现1个掺入错误；而Taq酶的错配率在5/10万。市场上的常见高保真酶种类很多：有Pab、Pfu、Pwo、Kod等，以Pab的错配率最低（0
6、.66x10-6）,耐热程度最高（100℃煮沸5小时，还有80%活性）。目前市场上的PCR酶按其组成成份来区分，可分为下列几种：1、纯高保真酶：扩增速度较慢，保真性最高，但扩增长度4-6kb；2、纯Taq酶：扩增速度较快，但峰值仅4kb左右；locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogot
7、Afewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame3、嵌合分子PCR酶：如NEB的Phusion，PangoGene的Paq等，这类PCR酶集保真性、速度、长度于一身，保真性强于Taq，扩增长度可达8～10kb。4、混合PCR酶（BlendDNAPolymerase）：高保真酶由于3’→5’外切酶活性，“能进能退“，常常进3步退2步，所以，其总体聚合速度慢（30～60bases/sec），但其具有修改错误的能力；Taq酶的聚合速度快（80～120bases/sec）,但”不细心“，常常拿错了碱基，一旦发生了掺入错误
8、，她就会停下来等待，由于其没有3’→5’外切酶活性，所以，要么就”将错就错“掺入，要么就撒手逃跑，留下没有完
