bfgfplga缓释微球对兔膝关节软骨不同面积缺损修复的实验研究

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1、Y．792861学校代码：学号：10610B020626四川大学临床医学博士专业学位论文bFGF／PLGA缓释微球对兔膝关节软骨题目丕国亘褪筮塑丝复的塞验盈究二oo五年四月四川大学华西临床医学院临床医学博士学位论文bFQF／PL6A缓释微球对兔膝关节软骨不同面积缺损修复的实验研究研究生张晖导师裴福兴教授摘要目的：(1)在体外观察自行研制的bFGF／聚乳酸一羟基乙酸共聚物(PLGA)缓释微球对骨髓基质干细胞(BMSCs)生物学特性的影响，为其体内动物试验提供理论基础。(2)建立不同面积的兔膝关节软骨缺损模型，应用关节内注

2、射bFGF缓释微球的微创方法，观察自行研制的bFGF／PLGA缓释微球对不同面积的兔膝关节软骨缺损修复的作用。(3)对于应用bFGF／PLGA缓释微球不能修复的面积，我们将微球与II型胶原海绵联合应用，观察修复效果。通过上述实验为临床应用bFGF／PLGA缓释微球修复大面积关节软骨缺损作前期研究。方法：1．体外实验：(1)在细胞培养技术下，不加bFGF或将游离bFGF或bFGF／PLGA缓释微球加入第二代兔骨髓问充质干细胞培养液中，用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(bITT法)、流式细胞仪观察细胞在第1，2，

3、4，7及10天增殖的状况，并进行统计学分析。(2)检测在特定的相同的成软骨诱导分化条件下，不加bFGF或加入游离bFGF或bFGF／PLGA缓释微球对诱导BMSCs成软骨分化后，蛋白多糖和II型胶原生成的影响。2．体内实验：四川大学华西I脑床医学院临床医学博士学位论文(1)选择健康成年新西兰大白兔48只，按建立的骨一软骨缺损模型面积的大小及治疗方法的不同分成A组5x5x3mm(游离对照组)、B组5x5x3mm、C组5x7x3mm、D组5x9x3mm、四个处理组。按分组关节内分别注入游离bFGF和bFGF／PLGA缓释微

4、球。术后4周、8周、12周收集标本，通过大体观察、组织学评分、免疫组化和原位杂交检测II型胶原、蛋白多糖的定量检测，分析不同处理组软骨修复的情况。(2)对于微球不能修复的缺损组，将微球与II型胶原海绵联合应用或单独应用II型胶原海绵进行治疗，观察修复效果。结果：l，体外实验：(1)培养1d后，三组细胞计数、吸光度(OD)值差异均无显著性意义；2d时，bFGF组的BMSCs细胞数高于其余二组，差异有显著性意义(q检验P<0．05)；4d时，各组MSCs细胞依次为：PLGA微球组>bFGF组>空白对照组，各组间差异均有显著

5、性意义(玎检验，P<0．05)；培养7d、10d时，微球组与上述两组仍有显著性差异。流式细胞仪检测显示，培养2d时，bFGF组的增殖指数最高，4d后PLGA微球组增殖指数最高。(2)在第7天，II型胶原免疫组化阳性，游离组与微球组之间没有显著性差异口>O．05)，第14天，3组均有显著性差异(P<0．05)，微球组>游离组>空白组。2．体内实验：(1)在游离bFGF治疗的A组，12周后软骨层和软骨下骨均未能得到修复，已填充的修复组织组织学检测多为纤维组织，蛋白多糖和II型胶原的含量均明显低于微球组，组织学评分低于各微球

6、治疗组。在微球治疗组中，B组(5x5x3mm)所有缺损在术后4周，即得到完全填充，填充细胞以圆形类软骨细胞和纺锤形的未分化的间充质细胞为主，并且在II四川大学华西临床医学院临床医学博士学位论文术后8—12周中，修复组织的细胞学形态逐渐接近正常透明软骨细胞。术后12周时，修复组织的甲苯胺蓝染色、蛋白多糖含量定量检测和Ⅱ型胶原免疫组化、原位杂交检测显示其基质成分如蛋白多糖和Ⅱ型胶原等，明显高于其它各组；而在其它各微球治疗组，随缺损面积的增大，缺损填充度、蛋白多糖和II型胶原含量呈逐渐下降趋势，修复的软骨层较正常软骨薄且以纤

7、维软骨为主。12周时，B组的组织学评分明显优于C、D组。(2)术后12周，微球联合应用II型胶原海绵组的缺损以类透明软骨修复，组织学评分优于单独海绵治疗组，有显著性差异。结论：(1)微球通过较长时间持续释放活性bFGF，能长期显著地促进兔骨髓间充质干细胞的增殖。在特定的成软骨诱导分化条件下可促进BMSCs向软骨细胞分化并促进其蛋白多糖和II型胶原生成，优于游离bFGF诱导组，差异有显著性。(2)关节内注射PLGA缓释微球的微创方法，能有效促进5x5x3mm兔关节软骨缺损的修复。其效果与游离bFGF组和更大面积组相比有显

8、著性差异。PLGA缓释微球对兔关节软骨缺损的修复有一定面积的限制，对5x5x3mm大小的缺损，在12周内可完成对其修复，修复组织为成熟的类透明软骨，表现为圆形软骨样细胞和蛋白多糖、II型胶原为主的细胞外基质。而当缺损面积超过此面积时，其修复组织以纤维软骨组织为主。(3)对于单独应用微球不能修复的更大面积的关节软骨缺损，将II型胶原