adamts4在多种软骨中的表达

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1、万方数据·228·主堡处整苤查!塑!生；旦笠堑鲞筮!翅g!边』!!垡：￡!!翌!翌!Q!!：!!!：堑：堕!：!ADAMTS4在多种软骨中的表达闫新峰常晓天张明汤继文吕厚山赵燕为了观察人骨关节炎(OA)病变过程中聚蛋白多糖酶与申晚期0A的关系，我们对0A软骨进行了免疫组织化学研究，并与正常软骨以及白细胞介素．1(IL一1)刺激模拟炎性关节炎软骨的结果进行对比，希望通过比较ADAMrrs4蛋白和mRNA在组织中的表达变化，发现该酶在OA发病过程中的作用和致病机制。资料与方法1．组织处理：15例0A软骨标本取自接受全膝关节置换患者的股骨髁。将软骨自软骨下骨表面全

2、层剥离，每例标本先取部分软骨用于免疫组化试验；再应用关节镜刨刀套截取直径4．5mm软骨块，每例10块，其中4块做RT-PcR，另6块经组织块培养及IL-l刺激后，4块用于RT—PcR，2块用于免疫组化染色。3例正常软骨取自山东省千佛山医院关节中心骨库深低温冷冻标本，软骨同样取自股骨髁，并经肉眼观察及病理切片证实无软骨退变。每例标本取部分软骨用于免疫组化染色实验，取直径4．5mm软骨块4块做RT—PcR，未做组织培养。用于RT—PcR的标本实验前保存于一80℃冰箱中，用于免疫组织化学实验标本应用10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋。2．组织块的培养方法：应用6孔细

3、胞培养板，每孑L放入6块软骨块，加入含有10％小牛血清的DMEM细胞培养液培养12h后，移除培养液，改用含有IL一1B(10n∥“)的培养液培养24h，再用不含IL．1$的培养液每天换液培养5d。3．RT—PcR：用液氮速冻软骨块，在盛有液氮研钵中将软骨块磨成粉末，再把粉末转移到50fnl锥型管，提取总RNA(按照上海申能博彩公司T曲lue说明书进行)。根据NcBI基因数据库公布ADAMTs4mRNA核苷酸顺序，应用Primer3设计了PcR引物：5’一tcggacttagctgggagaaa-3’和5’一tatcaccaccaccctggatt一3’。按照

4、Takara0neStepPCR试剂盒说明书测定ADAMTs4mRNA在软骨TotalRNA中的表达，产物用TBE凝胶电泳观察。4．免疫组织化学染色：石蜡切片厚度为7～10斗m。抗ADAMTs_4寡肽YNHRTDLFKSFPGP的兔多抗购于abcam公司。按福建迈新ultrasensitivesP超敏试剂盒说明书完成免疫组织化学实验。作者单位：250014济南，山东大学山东省千佛山医院骨科(闫新峰、张明)；山东省医药生物技术研究中心(常晓天、赵燕)；山东大学齐鲁医院骨科(汤继文)；北京大学人民医院骨科(吕厚山)通讯作者：汤继文，Email：yaIlx佑70@

5、hotⅡ1ail．com．短篇论著．5．结果评定标准：将软骨自关节面侧至软骨下骨侧分成表层、中层和深层。表层软骨细胞呈梭形，与关节面平行排列；中层细胞呈椭圆形或圆形，单个或多个成团排列；深层细胞呈圆形，多个细胞形成与软骨垂直的索条。ADAM，I’s4表达在细胞浆中，阳性细胞被染成棕色。由同一实验员在软骨表层、中层和深层分别随机计数100个细胞(5～8个高倍镜视野)计数阳性细胞总和。RT—PcR结果应用仪器(BioscansscB10A)所带软件给出的ADAMTS_4与B_actin的吸光度比值。所有结果均应用sPss10．0软件进行f检验，以尸

6、差异有统计学意义。结果1．不同软骨中ADAMTs4阳性细胞均数的比较：阳性细胞主要表达在软骨的表层和中层，深层细胞几乎未表达，具体数据见表1。表1不同软骨中ADAMTS4阳性细胞均数的比较注：与中层比较，8尸

7、或中层暴露部分的软骨。ADAMTs-4阳性细胞主要出现于浅层中，图2从左到右中层磨损依次加重，阳性细胞仍然主要出现在浅层。浅层表达ADAM，rS4的阳性细胞总数为63．2±14．4，与未暴露的中层或深层细胞阳性数6．8±2．4相比明显增多(P

8、，与未经过IL-1刺激的0A软骨表达0．88±0．4