用互补dna分子杂交技术研究番茄丛矮病毒组病

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维普资讯http://www.cqvip.com竺_微生物学通报■—．用互补DNA分子杂交技术研究番茄丛矮病毒组病毒RNA序列的同源性安鹄采甚小清【西北：冀业学埴保系，陕杨睦)摘要分别以TBSV一、AMCV一、PLCV—PAMV一和CyRSV—RNA为模板反转录合战的eDNA和每个同源或异源的RNA进行斑点杂交，研究番茄丛矮病毒组病毒RNA序硎的同源性。结果表明，TBSV和PLCV(2％)及AMCV(22％)、AMCV和PLCV(25％及PAMV(24％)之闭的RNA有较大的序列同源性，CyRSV—RNA和每个病毒RNA之间的同澡性低。．关键词分子杂交；植物病毒；番茄驭矮瘸毒组有关番茄丛矮病毒组(Tombusviruses)分材料和方法类问题的讨论由来已久”，而且至今尚未结束。在植物病毒描述中，番茄丛矮病毒Tomato(一)病毒的提纯BushyStuFitVirus(TBSV)做为这一组典型TBSV、AMCV、PAMV、PLCV、EMCV成员，而将菊芋斑皱病毒ArtichokeMottle和CyRSV分别在Nicotianabenthomiana烟CrinkleVirus(AMCV)、荷兰石竹意大利环草上繁殖，接种后5一l0天收集发病叶片，并立斑病毒CarnationItalianRingspotVirus一即在含肓l％抗坏血酸的50mtool／L醋酸盐(CIRV)、天竺属植物叶卷病毒Pelargonium缓冲液(pH5O)中匀浆，用醋酸调节pH到LeafCureVirus(PLCV)和矮牵牛星状花叶4．5，使滤液澄清，低速离心(8000r／min，l5分病毒PetuniaAsteroidMosaicVirus(PAMV)钟)，用NaOH调上清液pH到6．0，用聚乙二做为TBSV的株系。但在第四届国际病毒分醇(PEG6000)和02tool／L醋酸盐缓冲液类委员会报告中，根据病毒粒子为球状二十四(pH5．0)。病毒粒子进一步提纯采用CsCI密面体及单链RNA特点，认为番茄丛矮病毒组包度梯度离心(Beckman，36000r／min，l6小括以下7个确定成员：TBSV、AMCV、CIRV、时)，用注射针头收集病毒粒子带，用50mmol／PLCV、PAMV、茄斑皱病毒(．EggplantMo—LNaCt(pH55)溶液透析除去CsC1。tt!eCrinkleVirus一一EMcV)和剑兰属植物(二)RNA的制备环斑病毒(CymbidiumRingspotVirus——将所得病毒用两相酚一SDS法抽提病毒桉CyRSV)。虽然通过血清学方法可以将各个成酸，RNA的进一步纯化采用蔗糖密度梯度离员区别开来，但它们之间的血清学关系却很复心36000r／min16小时。收集RNA带，加二杂，亲缘关系变化也很大，CyRSV仅和TBSV倍乙醇沉淀RNA，沉淀悬浮在无菌蒸馏水中。有血清学关系，其它各病毒间的亲缘关系尚不(三)P—eDNA的制备清楚。本文用cDNA分子杂交技术-_--斑点按照TayJot的方法，分别制备TBSV、杂交法(DotBlotHybridization)研究TBSV、AMCV、EMCV、PLCV、PAMV和CyRSVAMCV、EMCV、PLCV、PAMV和CyRSV各基因RNA的互补DNA。将05t~-g的各相互之间RNA序列同源蛙，并对它们进行亲RNA样品和试剂，按以下顺序分别加入灭菌的缘性程度顺序的排列，和血清学测定结果进行Eppendorf管内：5ml随机引物(10mg牛胸腺比较分析。DNA加03mg的DNase，在37~C下裂解8 维普资讯http://www.cqvip.com微生物学通报小时)、1．251随机引物缓冲液(1OOmmol／L斑点剪下，用闪烁计数器测定每个斑点的放射MgCI2、50mmol／LKCI、1OOmtool／LDTT、性强度(cpm)。40mmol／LNa．0，)、O．2lRNA酶抑制剂结果(75个单位)、1l反应底物(20mmol／LdATP、dGTP、dTTP和1．6mtool／LdC'rP)、(一)斑点杂交11Ⅱ一P—dCTP(1Oucl／1)，最后加入0．5l因为TBSV和CyRSV病毒的RNA链·(5个单位)禽类白血病毒(AMV)反转录酶，混端不含有多聚腺核苷酸(PolyA)，因此，本合均匀后，在37~C水浴中保温9O分钟，然后加实验所有cDNA的合成都采用由DNaseI裂入6．5lINNaOH，在60~(3保温60分钟，终解牛啕腺DNA后的短DNA片段做随机引止反应并水解模板RNA，加6．5lINHCI物。根据我们的实验经验，用DNaseI在37~(3中和前面加入的NaOH，使反应液呈中性。用下裂解牛胸腺DNA8个小时，所得到核苷酸预先平衡过的SephadexGSO柱收集cDNA片段只有4—6个碱基残基(3％的碱性琼脂糖<平衡液为IOmtool／LNaC!，Imtool~L凝妓电泳测定大小)。用此j【物来合成cDNAEDTA。1Omtool／LTrisHC1，pH8．0)，用上的效率较高，而且t,／l-32P—dCTP在cDNA中述平衡液洗脱15次(每次loot~1)，收集每次洗的结合率也高(Inc0rpora【ion)。将RNA点脱液，并用液体闲烁计数器测放射性强度样到硝酸纤维膜上以前，没有必要将RNA进^(cpm)，收集台有标记cDNA样品的第一个行变性处理，不变性的RNA可以牢固地结台放射埠。在膜。(四)RNA斑点制备和斑点预杂交(二)RNA序列同源性将各个RNA样品(hlg／t,1)用微量点样器点到预先用20XSSC平衡过的硝酸纤维膜斑点杂交后，将每个RNA膜斑点在严格上，每次点样为3．2l，斑点大小为0．5cm左条件下洗脱(0．1×SSC、0．I移SDS溶液，在右，点样后将膜在80'~C真空干燥2小时，然后65~(3下洗脱30分钟)，以除去非特异性杂交将膜放人含有50％HCONI-Iz、5XSSC、0．02弼体。然后将每个cDNA和同源或异源RNABSA、002％Ficoll、0．02弼PVP、50m·tool／杂交后的斑点剪下，用闪烁计数器、蜊定每个斑LNaPO．、250~g／ml变性鲑鱼精子DNA的点的放射性强度，计算出每个cDNA与异源预杂交缓冲液(pH6．5)中进行预杂交(42~c，RNA序列同源性的百分比(表1)。3小时)，以减少探针DNA在滤膜上非杂交性从表L结果得出：(1)在番茄丛矮病毒组曲吸附。内，一些病毒RNA相互之间有较高的同源性，(五)斑点杂交如TBSV和PLCV、AMCV和PLCV、PAMV在上述预杂交液中分别加入1／lO体积的等；(2)测定出各病毒RNA相互之间同源性各个变性’一cDNA(100~(3水浴中加热7分程度。TBSV和其它病毒RNA之间的同源性钟后。立即在冰水浴中冷却)组成杂交缓冲液，顺序嵌次为：PLCV(24％)、AMCV(22％)、和预杂交后的膜进行eDNA分子杂交(4Z~C、PAMV(15弼)、EMCV(8％)、CyRSV(6％)。18小时)。AMCV和其它病毒RNA之间同源性顺序依(六)杂交后的洗脱和检测次为：PLCV(25弼)、PAMV(24，舀)、TBSV分别用2XSSC、0．01移SDS和0．1XSSC、(2O％)、EMCV(1l％)、CyRSV(7％)。同。0．1西SDS溶液在室温下洗脱20分钟并在50—样，我们也可看出PLCV、EMCV、CyRSV和90℃范围内(温度梯度为2℃)洗脱30分钟，其它病毒亲缘关系的程度。很明显，CyRSV与将膜烘干(40~C，30分钟)后将每个RNA膜其它病毒的亲缴关系都较远。 维普资讯http://www.cqvip.com徽生物学通报寰I番茄丛矮瘸毫组吝成员之间RNA序爿同薄性百分比、＼＼菩#RNA、＼挂板的eDNATHSVAMCVPAMVPLCVEMCVCyRSV病毒的RNA～＼TBSV100l819107AMCV222{29124PAMV151001916，PLCV2{l4l00103EMCV871l10O10CyRSV6554100注：表中同矗性百分比值均为两改重复的平均值RNA之间有较多的碱基配对。因此它们之间有(三)eDNA—RNA杂交物的熔解曲线较高的同潦性。AMCV·cDNA和CyRSV—RNA当P—eDNA与同源或异潦的RNA杂之间的杂交物Tm值低(Tm一55℃)，这说交时，固定在膜上的RNA和cDNA形成杂交明它们之间核苷酸序列的同源性低，这些结果体，为了除去非特异性cDNA·RNA杂交体和与表1测定RNA序列同源性百分比的结果一测定同潦的cDNA·RNA杂交体的热稳定性，致。在50-90~C范围内进行严格漂洗，漂洗后，测讨论定每个膜斑点的放射性(图1)oAMCV-cDNA与PLCV—PAMV-RNA之间的杂交物Tm值近几年来，核酸的分子杂交技术日趋完善，较高，说明AMCV·cDNA与PLCV一和PAMV一以不同材料为支持物的固相杂交技术取得了更为迅速的发展。在植物病毒方面，最初将RNA周定在硝酸纤维膜上的固相杂交技术是用来检测植物汁液中的病毒和类病毒，经试验证明这一方法同样可以用来检铡病毒RNA序列同源性。斑点杂交法具有简便、快速的特点，而且样品比较集中，灵敏度高。因为以病毒普RNA为模板合成的互补DNA能代表整个病毒基因所携带的遗传信息，而血清学技术和外堞壳蛋白亚基的氨基酸组成及顺序都只能代表整个病毒RNA所携带遗传信息的一小部分．因此，用eDNA分子杂交技术测定不同病毒核苷酸序列的同源性，并进行病毒的分类是理愠度(℃)想的，也是可行的。将本实验结果和血清学测定结果进行比周lAMCV的eDNA和组内不同病毒RNA之间杂交物的热熔解曲线较(表2)，可以看出：(1)大多数RNA序列同o-oAMCV—RNA●一●PLCV—RNA源性百分比和SDI值相近；(2)我们能从杂交0—0CTRSV—RNA▲一▲TBSV—RNAX—XEMCV—RNAA—APAMV—RN^结果直接看出各RNA之间的亲缘程度，而SDI各病毒的Tm值：Tm(AMCV)73，5℃，值仅能表示各病毒之间血清学关系的紧密程"rm(PLCV)一65屯，Tm(PAMV)62，3℃，度；(3)CyRSV和PLCV之间有10两RNA叮m(TBSV)=60℃，Tm(EMCV)58屯，Tm(CyRSV、55屯序列同源性。而SD!值(>9)则表示它们之间 维普资讯http://www.cqvip.com·260·微生物学通报199]年18(5)寰2eDNA分子杂变法舅定的目性百分比和血清学重尉指截的比较R病N毒AAPMACMVV，APMLCVVfPLACMVV，EPMACMVV』AEMMCCVV，PELMCVC，VCAyRMSCVV／CyRSV／fCyRSVv]fC~RSV／————一——I——————同娘性百丹比一二一I～L一血清别学指鉴数>9>f>{>注：血请学鉴别指数愈小，病毒幕缘性关系m离，反之亦然没有血清学关系。另外，AMCV和PLCV的参考文献RNA序列同源性百分比和SDI值也有差异，这些差异可能是由于血清学方法的局限性所1KoeMngR¨】：J．GenViro1．697—82、t986．2Mar~e][iGPetal：CM．I／A．ABDescription0f致。为了进一步揭示番茄丛矮病毒组RNA序PlantVLrus．No69．t97I列的同源性，可通过对每个病毒的RNA碱基jMurteIliGPeta1．：l口theAltasofInsectandP／antVit1,s，I977序列进行分析。我们希望这一技术也象eDNA}．TaylorJMeta】：Bi~him．BiophysAcla．442：3Z}一杂交技术一样，经不断改进成为确定病毒基因{30l76之间同源性的有力工具。．ThomasPS：Methodsin~'nzymologyIO0：25—266．1983．弗州新接合霉在桔全爪螨中的流行黄耀坚邱丽绚郑本暖(福建林学院，南平)摘娶1990年春发生于福建南平市郊桔全爪蛹群体的虫霉流行病，其病厦骞定为弗州新接台霉。经毒力、宿存力以及传播建径等初步考察结果表明：该菌具有较高的流行能力。流行病的消长显示：果园的郁闭度和阵雨量是髟响疾病流行的主要生态因子；高郁闭度果园中弗州新接台霉对拮生爪螨种群密度具显著的调节作用o*键词桔套爪螨；弗州新接台霉：流行病自Weiser和Muma对感染斑氏真叶螨以及杀虫剂对疾病流行的影响．-．。本文报道的弗扑I新接台霉(Neozygitesfro,，dd—了弗州新接台霉感染桔全爪螨(PanonychusEntomophthorai／oridana)鉴定工作以来，弗cirri)的病原国内首次观察结果，分析了该菌州新接合霉作为螨娄的重要病原以及生防中措的流行潜力以及影响流行的生态条件。。往的窟用价值已为众所周知和共识。在流材料和方法行病学方面，Ramaseshiach观察了该菌在印度的流行、寄主范出及分布；Keneth和Bra-1．病原的观察采用常规的虫霉观察方法；ndenburg分析了间越冬的宿存机制；Ne—moto报道了日本的流行；Brandenburg和闻辜自然科学基盎资助项目。安被农学院李增暂先生对本工作提出宝贵意见，特此致一Boykin等分别探讨了田间病原与寄主的关系谢。