核酸的酶促降解和核苷酸代谢课件

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1、第十三章核酸的酶促降解和核苷酸代谢本章讨论核酸酶的类别和特点，对核苷酸的生物合成和分解代谢作一般介绍。第一节核酸的酶促降解第三节核苷酸的合成代谢第二节核苷酸的分解代谢第一节核酸的酶促降解核苷酸酶核苷磷酸解酶核酸核苷酸核苷碱基+核糖-1-P磷酸核酸酶核苷水解酶碱基+核糖脱氧核糖核酸酶(DNase)核糖核酸酶(RNase)非特异性核酸酶核酸酶1、核酸酶的分类（1）根据对底物的专一性分为（2）根据切割位点分为核酸内切酶核酸外切酶2、核酸酶的特异性3、限制性内切酶外切核酸酶对核酸的水解位点5´ppppOHBpppp3´BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶（

2、5´端外切5得3）蛇毒磷酸二酯酶（3´端外切3得5）内切核酸酶对RNA的水解位点示意图5´ppppOHPyPuPyPy1´pppGACUpppGA3´RNAaseIRNAaseIRNAaseT1RNAaseT1Pu：嘌呤Py：嘧啶限制性内切酶类型命名和意义限制片段的长度限制图原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（ristrictionendonuclease）。常用的DNA限制性内切酶的专一

3、性酶辨认的序列和切口说明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口限制性内切酶类型I型：分子量大于105，多亚基，需S-线苷蛋氨

4、酸、ATP和Mg2+，识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限制与修饰相排斥的多功能酶.Ⅱ型：分子量小于105，需Mg2+，切割位点位于识别位点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物学研究所用的限制性内切酶均为此类。ⅡI型：识别位点为5-7bp的非对称序列，切割位点在顺序之外离识别序列5-10bp，切割双链，个别也切割单链。是限制与修饰相多功能酶.限制性内切酶的命名EcoRI序号属名种名株名例：EcoRI，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶Hind例：流感Haemophilusinfluengaed

5、（属名）（种名）（株系）I—特异性甲基化酶II—GTPyPuACIII—AAGCTT限制性内切酶的意义限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。限制片段的长度根据估算，识别六核苷酸顺序的的限制酶大约在4096（46）个硷基对长的DNA分子中有一个切点，而通常大多数肽链的不超过1000氨基酸残基。因此，由识别六核苷酸顺序的的限制酶产生的DNA片段接近一个原核生物基因的大小，这个性质使得这些限制酶可以用于建造和克隆有用的重组DN

6、A分子。为了获取更大的DNA片段，可以采用限制酶部分降解的方法，也可以选用识别8～10个核苷酸顺序的限制酶。限制图的定义和构建限制图（亦称物理图谱）是DNA的限制性内切酶酶解片断沿DNA分子的物理位置的排列顺序以及各片断的相对长度和绝对长度。由于限制性内切酶能在独特顺序切割双链DNA产生大的DNA片段，它们提供了一种以碱基对为单位距离给DNA分子作图的方法，在确定DNA分子一级结构的过程中，限制图的构建是一项必不可少的工作。限制图制作方法示例：末端标记单酶切法SV-40基因组限制性酶谱SV-40病毒基因组限制性物理图谱末端标记法绘制物理图谱

7、将待测DNA分子的一端用放射性同位素标记，部分酶解；电泳分离，只有带同位素的片段出现在放射自显影图上；.分析：放射自显影图上谱线的数目相当于完全酶解片段的数目；相邻谱线碱基对数目之差就是两个相邻点之间这段DNA片段的大小。例：某组蛋白基因片段共5900bp，末端标记后用HpaII部分酶解得到五个片段，分子量分别为：5900bp；4210bp；3260bp；2950bp；1020bp。画出该DNA分子的物理图谱。193010201020bp2950bp3260bp5900bp4210bp3101690950+-Mark限制性

8、内切酶解法部分酶解法将待测DNA用限制性内切酶完全水解，电泳后得完全酶解图谱.再将待测DNA进行部分酶解(限制酶量、降低温度、缩短反应时间),电泳后获得部分酶解图谱.对完全