SNT1152-2002鲤春病毒血症病毒(SVCV)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1152-2002鲤春病毒血症病毒(SVCV)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法Testmethodofreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)forspringviraemiaofcarpvirus(SVCV)2002-11-25发布2003-05-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总辰SN/T1152-2002nil吕本标准是在总结我国在这一领域的实践经验并参考国际上有关检测规程的基础上

2、制定的。本标准的附录A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:江育林、高隆英、刘羞、史秀杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T1152-2002鲤春病毒血症病毒【SVCV)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法范围本标准规定了细胞分离病毒后，用PCR技术诊断Svc病毒的方法。本标准适用于Svc病毒的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准

3、的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987)GB/T18088-2000出人境动物检疫采样试荆和材料3.1水应符合GB/T6682-1992中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水要用DEPC处理以除掉RNA酶。3.2SVC病毒标准株3.3Taq酶一20℃保

4、存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4逆转录酶AMV10U/mL。一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5RNA抑制剂(RNasin)40U/pL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.6dNTP(含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmoL/L)3.7引物该试验选用Svc病毒的糖蛋白基因作为PCR的模板。该基因长1588by，在这里用了2对引物:F1和R2扩增该基因中的714by片断，而Fl和R4则从该片断中再扩增606by片断。所以实际上是“半嵌套式”的PCR(semi-nestedPCR

5、)。使用时浓度为40pmol/L。其序列如下:R2:5'-AGATGGTATGGACCCCAATACATHCANCAY-3'R4:5'-CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY-3'Fl:5'-TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC-3'SN/T1152-20023.8无水乙醇分析纯，使用前预冷到一20'C.3.9矿物油要求无DNA酶和RNA酶.4器材和设备4.196孔细胞培养板4.2倒置显微镜4.3恒温培养箱4.4普通冰箱和低温冰箱4.5组织研磨器46离心机和离心管4.7PCR扩增仪4.8电泳仪4.

6、9微量移液器及吸头4.10紫外观察灯5SVC病毒的分离5.1采样对有临床症状的鱼，如是体长小于等于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm-6cm的鱼苗取内脏(包括肾);体长大干6cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、脾、鳃和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。按GB/T18088-2000采样。5.2样品处理应在10℃以下。先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再按1:10的最终稀释度重悬于培养液中.如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有1000TU/mL青霉素和1000pg/mL链霉素的培养液中，于

7、15'C下孵育2h-4h或4℃下孵育6h-24h,7000r/min离心15min，收集上清液。卵巢液也要用上述浓度的抗菌素处理以防污染。不必匀浆但需稀释2倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。5.3病毒分离对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1:10,1:100和1:10003个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24h的EPC,CO或者FHM细胞单层中，每孔(2cm')的细胞单层最多接种100t}L稀释液。15'C-20℃吸附。·5h-lh后，加人细胞培养液。置于1

8、8℃士2℃培养。试验中要有2孔阳性对照(接种SVC标准株)，和空白对照(未接种病毒的细胞)。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感