SNT1151.4-2003对虾黄头病毒(YHV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1151.4-2003对虾黄头病毒(YHv)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法Protocolofreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)foryellowheadvirusofshrimp(YHV)2003-05-28发布2003-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T1151.4-2003.月岛召q..青.‘月本标准的附录A是规范性附录，附录s是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和

2、国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:刘左、史秀杰、高隆英、江育林。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T1151.4-2003对虾黄头病毒(YHV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法1范围本标准规定了用逆转录聚合酶链式反应技术检测对虾黄头病毒的方法。本标准适用于对虾黄头病毒的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，

3、其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987)3试荆和材料3.1水:应符合GB/T6682-1992中一级水的规格。3.2Taq酶:-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.3逆转录酶AMV:-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化.3.4核糖核酸酶抑制剂(RNasin):一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5dNTP(含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmol/L),3.6引物:浓度为40kmol/L。其序列如下:上游引物10F:5'-CCGCTAATTTCAAAAACTACG-3'下

4、游引物144R:5'-AAGGTGTTATGTCGAGGAAGT-3'3.7异丙醉:分析纯，使用前预冷到一200C,3.8矿物油:要求无DNA酶和RNA酶。3.9标准分子量:推荐使用pUC19DNA/MspI

5、理前要将样品放在冰上。如果2h以后才能处理，宜将样品保存在无水乙醇中，无水乙醇体积是样品体积的10倍以上，可放置在室温下保存4个月。血淋巴样品需保存在一70r,5.1.2对于仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作样品。取虾头时，用灭菌剪刀和镊子去除眼睛、头胸甲、所有的胸部附器和头部以后的腹部。5.1.3对于成虾，取鳃丝、淋巴器官或血淋巴作为样品.5.1.3.1取鳃丝时，用灭菌剪刀剪去头部两侧的头胸甲，露出鳃丝，然后用剪刀剪取鳃丝。5.1.3.2取淋巴器官时，要除去头部以后的腹部，并切除头胸甲前方的嚎部。从头胸甲中间，将头胸部分为两部分，暴露出内部的组织器官。在胃的腹侧、肝胰腺的后面，取出

6、白色、呈二裂片状的淋巴器官.5.1.3.3取血淋巴时，先用1mL针管吸取500pL10%的柠檬酸盐溶液(见附录A中第A.1章)，然后在针管前插上一个26号的针头。抓住对虾，使腹部朝上‘将针头水平地插人第一和第二对游泳足之间，并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处。缓慢吸取血淋巴。5.2制样在15℃下，在1.5mLPCR管中首先加人25mg-100mg组织或200I.L血淋巴柠檬酸盐混合液，再加人150pLCTAB溶液(见附录A中第A.2章)，用小剪刀剪碎，然后用均浆器将样品均浆成糊状。再加CTAB溶液到900pLa混匀后置于25℃作用2h.YHV核酸的鉴定6，I核酸抽提首先加600

7、KL抽提液1(见附录A中第A.3章)，充分混合至少30s;12000r/min离心5min，取上层水相。再加700KL抽提液2(见附录A中第A.4章)。充分混合30s;12000r/min离心5min，取上层水相。然后加人1.5倍体积的一20℃无水乙醇，混匀后，-20℃放置6h以上。15000r/min离心30min，弃上清，立即用滤纸吸干，37℃干燥20min。最后加10pL水溶解后，作为PCR模板，6.2变性和退火在PCR管中加人10pL模板和5pL引物(上游引物和下游引物各2.5yL)