SNT1151.1-2011虾桃拉综合征检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１５１．１—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２虾桃拉综合征检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊犺狉犻犿狆狋犪狌狉犪狊狔狀犱狉狅犿犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１前言ＳＮ／Ｔ１１５１系列标准共分为六部分：———虾桃拉综合征检疫技术规范；———对虾白斑病检疫技术规范；———斑节对虾杆状病毒（ＭＢＶ）诊断方法；———虾黄头病检疫技术规范；———对虾杆状病毒（ＢＰ）

2、检验方法；———对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程。本部分为ＳＮ／Ｔ１１５１的第１部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分代替ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２《对虾Ｔａｕｒａ综合征病毒（ＴＳＶ）逆转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）诊断方法》。本部分与ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２相比，主要技术内容变化如下：———整合和优化ＲＴＰＣＲ检测方法；———新增ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测方法。本部分修改采用世界动物卫生组织（ＯＩＥ）的《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）第２．２．４章，并对虾桃拉综合征ＲＴＰＣＲ检测方法进行了整合和优化。本部分

3、由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本部分主要起草人：熊炜、张强、刘荭、郑腾、蒋静、李健、邱璐、王巧全、黄忠荣、胡永强。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２。Ⅰ版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１虾桃拉综合征检疫技术规范１范围ＳＮ／Ｔ１１５１的本部分规定了虾桃拉综合征ＲＴＰＣＲ和ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测的操作方法。本部分适用于虾桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。２规范

4、性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３概述桃拉综合征（Ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅ）是一种由桃拉综合征病毒（Ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＴＳＶ）感染而引起的严重威胁虾养殖的重要疫病，它是世界动物卫生组织（ＯＩＥ）规定的需上报的水生动物疫病。ＴＳＶ几乎能感染所有类型的养殖虾，如：南美白对虾、红额角对虾、褐对虾、白对虾、斑节对虾等，并感染孵化期的虾苗，其致死率高。ＴＳＶ感染有三个明显的阶段：急性期、过渡期和

5、慢性期。在急性期，虾表皮上皮的组织切片中可以看到典型的病理损伤。而在过渡期和慢性期，却没有典型的病理损伤；虾发病死亡主要发生在急性期，急性感染后的幸存者在经过短暂的过渡期后，进入长时间的慢性感染期，处于慢性感染期的虾的淋巴器官终生持续有病毒存在，这些携带有病毒的虾可把病毒水平传播给其他易感虾。病毒学研究证实，ＴＳＶ是一种小的正二十面体无包膜病毒，直径３２ｎｍ，其基因组为单正链ＲＮＡ由１０２０５个核苷酸组成，含有两个大的开放阅读框（Ｏｐｅｎｒｅａｄｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），ＯＲＦ１编码非结构蛋白如解旋酶、蛋白酶和ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶等，ＯＲＦ２编码结构蛋白如衣壳蛋白ＶＰ１、Ｖ

6、Ｐ２、ＶＰ３（其分子量大小分别为５５ｋＤａ、４０ｋＤａ、２４ｋＤａ）。４试剂和材料４．１犜犪狇酶及１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液：犜犪狇酶浓度为５Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．２逆转录酶及１０倍逆转录酶浓缩缓冲液：逆转录酶浓度为５０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．３ＲＮＡ酶抑制剂：浓度为４０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．４ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。４．５ＲＴＰＣＲ引物：引物浓度均为２０μｍｏｌ／Ｌ；引物有两对，可任选其一使用；引物９９９２Ｆ和９１９５Ｒ为ＯＩＥ推荐引物，其扩增基因片段的大

7、小为２３１ｂｐ，引物ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增的基因片段大小为２９５ｂｐ，其序列如下：上游引物（９９９２Ｆ）：５’ＡＡＧＴＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＴ３’下游引物（９１９５Ｒ）：５’ＴＣＡＡＴＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ３’上游引物（ＴＳＶＦ）：５’ＡＴＴＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＣ３’下游引物（ＴＳＶＲ）：５’ＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＴＡＧＧＧＧＡＧ３’１版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１４．６ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴ