基于铜离子显色反应的比色免疫传感新方法

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1、分类号Ｏ６５７．１学号２０１５Ｘ０７０３０００３学校代码１０５１３密级撕炎卸範七專ＨＵＢＥＩＮＯＲＭＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文（学术学位）基于铜离子显色反应的比色免疫传感新方法作者姓名：黎波一级学科：化学二级学科：分析化学指导教师：赖国松教授答辩日期：２０１８年５月２３日AThesisSubmittedinFulfillmentofRequirementsfortheDegreeofMasterofAnalyticalChemistryNewcolorimetricim

2、munosensingmethodsbasedonthechromogenicreactionofcopperionCandidate:BoLiMajor:AnalyticalChemistrySupervisor:Prof.GuosongLaiHubeiNormalUniversityHuangshi435000,P.R.ChinaMay23,2018摘要肿瘤标志物的准确检测对于疾病早期诊断具有十分重要的意义。将基于高特异性免疫反应与荧光、比色、化学发光、电分析化学等信号转导相结合发展起来的免疫传感器用于肿瘤标志物检测，近年来得到了

3、人们广泛关注。其中，比色法由于仪器更为简单，信号转导更加直观方便，因而将其用于免疫传感器信号转导，与其它方法相比具有更好的实用价值。为了进一步提高传统比色免疫传感方法的分析性能，本论文将磁珠分析平台和铜离子显色反应的优良性质与酶催化反应和纳米探针等信号放大策略相结合，在癌胚胎蛋白(CEA)比色免疫传感新方法的构建方面开展了以下工作：1.基于铜离子显色反应的肿瘤标志物比色免疫分析新方法结合磁珠平台上的夹心免疫分析及铜离子显色反应，本工作发展一种可用于CEA肿瘤标志物快速、灵敏检测的比色免疫分析新方法。该磁性免疫分析平台通过在羧基化磁珠表

4、面共价固定包被抗体制备而成。在进行目标分析物CEA的免疫识别后，进一步将制备的抗体功能化氧化铜(CuO)纳米探针用于夹心免疫反应以在磁珠表面形成免疫复合物。定量捕获到该免疫复合物上的CuO纳米标记物接着通过加酸溶解，以释放出其中大量的铜离子。基于新合成的腙类显色剂(E)-1,2-二苯基-2-(2-(吡啶-2-基)亚肼基)乙酮(DPHE)与这些铜离子的配位反应生成一种红色络合物以用于比色信号检出，从而使得该免疫分析方法得以成功建立以用于CEA的灵敏检测。在最佳实验条件下，该方法拥有3个数量级以上的较宽线性范围，检出限为26pg/ml。此

5、外，该方法还具有成本低廉、操作快速方便、重现性和稳定性好、准确度高等优良性能。2.基于酶致生物矿化碱式碳酸铜的高灵敏比色免疫传感本工作中将酶功能化纳米探针的催化生物矿化碱式碳酸铜与灵敏的铜离子显色反应相结合，发展了一种高灵敏比色免疫传感新方法。该纳米探针通过在金纳米粒子(AuNPs)载体表面组装固定信号抗体和高含量的脲酶制备而成。通过在基于磁珠构建的免疫分析平台上的夹心免疫反应，CEA目标分析物和AuNP/脲酶纳米探针可依次被定量捕获到磁珠表面形成免疫复合物。纳米探针上的脲酶标记物可催化其尿素底物水解反应，产生大量的OH−和HCO−2

6、+3。进一步加入Cu之后，酶催化反应生成的这些离子可以快速与其结合，从而在免疫复合物表面发I生碱式碳酸铜的生物矿化。通过将该生物矿化产物加酸溶解释放出其中富集的Cu2+以进行其显色反应，从而可以得到一种红色配合物以用于本方法的高灵敏比色信号转导。在最佳实验条件下，该方法拥有5个数量级宽的线性范围，检出限低至0.45pg/mL。此外，该方法也具有成本低廉、操作方便，重复性、稳定性和准确度较好等优良性能。3.基于杂交链反应与酶致生物矿化信号放大的高灵敏比色免疫传感结合磁珠平台上的DNA杂交链反应与酶致生物矿化碱式碳酸铜，本工作发展了一种基

7、于铜离子显色反应的高灵敏比色免疫传感新方法。磁珠分析平台上的CEA免疫识别及其进一步特异性结合其核酸适配体链，可以引发两条具有特定碱基序列的发夹DNA链进行相互杂交反应。通过杂交链反应打开的发夹DNA末端标记的生物素对制备的链霉亲和素及脲酶双功能化AuNP纳米标记物的特异性结合，以及接下来酶催化生物矿化碱式碳酸铜作用对铜离子的定量富集、释放与显色反应，从而成功实现了该方法的比色信号转导。由于杂交链反应、纳米多标记信号放大及酶催化生物矿化作用均大大增强了免疫识别事件的信号响应，因而使得该方法具有很高的分析灵敏度。在最佳实验条件下，该方法

8、可在超过5个数量级的线性范围内实现对CEA的准确检测，检测限低至0.071pg/mL。此外，该方法也具有成本低廉、操作方便，重复性、稳定性和准确度较好等优良性能。关键词：免疫传感器；比色法；肿瘤标志物；磁珠；信号放大；纳