microRNA-181a和NPM1在喉癌增殖与凋亡中作用机制研究

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1、分类号：R394单位代码：10159密级：公开学号：201520804硕士学位论文中文题目：microRNA-181a和NPM1在喉癌增殖与凋亡中作用机制研究英文题目：StudyonfunctionalmechanismofmicroRNA-181aandNPM1inlaryngealcancerproliferationandapoptosis论文作者：佟雪指导教师：富伟能教授学科专业：遗传学完成时间：2018年2月中国医科大学硕士学位论文microRNA-181a和NPM1在喉癌增殖与凋亡中作用机制研究Studyonfunctionalme

2、chanismofmicroRNA-181aandNPM1inlaryngealcancerproliferationandapoptosis论文作者佟雪指导教师富伟能教授申请学位理学硕士培养单位基础医学院一级学科生物学二级学科遗传学研究方向肿瘤细胞分子遗传学论文起止时间2015年9月—2018年2月论文完成时间2018年2月中国医科大学（辽宁）2018年3月中国医科大学硕士学位论文摘要前言：喉癌是常见的恶性肿瘤之一，其中以鳞状细胞癌最常见。喉癌的病因复杂，与吸烟、饮酒、暴露于有害的尘埃有关。尽管手术、化疗、放疗和免疫治疗等多种治疗技术不断进步

3、，但在过去的10年中患者的5年总生存率并没有明显改善。因此，寻找喉癌初期诊断与个体化治疗的新型分子标志物是目前研究的热点。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长18～24个核苷酸的非编码小RNA，具有重要的分子生物学功能。研究发现，miRNA参与调节细胞的存活、自噬、增殖、凋亡以及迁移等重要生命过程。miRNA存在于人体多种体液中，在多种人类肿瘤中表达异常，参与多种肿瘤的发生发展，是目前极具价值的包括肿瘤在内的分子标志物。miR-181a是miR-181家族成员之一，可通过调控多种靶基因的表达，影响肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭和分化。

4、研究证实，miR-181a在胶质瘤、宫颈癌、肺癌和乳腺癌中发挥“抑癌基因”作用，而在肝癌和胃癌中发挥“癌基因”作用。目前，miR-181a在喉癌中相关研究未见报道。通过MiRanda等软件预测，我们发现NPM1是miR-181a潜在靶标之一。近年来，对NPM1的研究主要集中在其与血液系统肿瘤的关系。此外，NPM1在包括前列腺癌、肝癌、肺癌等一些实体肿瘤中高表达，提示其在肿瘤中发挥癌基因作用。然而，NPM1在喉癌中相关研究亦未见报道。本研究应用相关分子生物学技术检测了miR-181a和NPM1在喉癌中的表达水平，鉴定了miR-181a的靶基因NP

5、M1，并检测了二者在喉癌中分子生物学功能，为进一步探讨miR-181a在喉癌中的分子作用机制和作为喉癌分子标志物的可能性奠定了基础。材料与方法：1、细胞系和组织标本：人喉癌细胞系Hep2、人胚肾细胞系HEK293T、喉癌组织标本。2、实验方法：细胞培养、基因片段转染实验、qRT-PCR实验、流式细胞仪检测、CCK8实验和克隆形成检测、荧光素酶报告基因检测、SPSS统计分析。结果：1、qRT-PCR结果显示，与癌旁正常组织和HEK293T细胞相比，miR-181a在III中国医科大学硕士学位论文喉癌组织和Hep2细胞中表达水平显著降低（P<0.0

6、5），NPM1在喉癌组织和Hep2细胞中表达水显著增高(P<0.05)，二者转录表达水平呈显著负相关关系（r=-0.4185，P<0.01）。Westernblot结果显示，与癌旁正常组织和相比，NPM1在喉癌组织中蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。上述结果提示miR-181a和NPM1在喉癌中分别发挥潜在抑癌基因和癌基因作用。2、荧光素酶报告基因实验结果显示，在Hep2细胞系中，Lut-NPM1-Wt+miR-181amimic共转染组报告基因活性较对照组显著下降(P<0.05)。Real-timePCR和Westernblot结果显示，

7、转染miR-181amimic或miR-181ainhibitor后48h，与对照组相比，Hep2细胞中NPM1mRNA和蛋白表达水平分别显著降低和增高（P<0.05）。上述结果提示NPM1是miR-181a的靶基因。3、CCK8和克隆形成实验结果表明，与对照组相比，miR-181amimic转染组中Hep2细胞的增殖及克隆形成能力显著降低（P<0.05），miR-181ainhibitor转染组中Hep2细胞增殖及克隆形成能力显著增高（P<0.05），提示miR-181a抑制Hep2细胞的增殖。4、流式细胞术检测凋亡结果表明，转染miR-18

8、1amimic或miR-181ainhibitor后48h，Hep2细胞的早期凋亡比例较对照组分别显著升高或降低（P<0.05），提示miR-181a