Atg7调控纤连蛋白表达及其在血脑屏障形成中作用的初步研究

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1、分类号：Q28单位代码：10159密级：公开学号：201320017硕士学位论文中文题目：Atg7调控纤连蛋白表达及其在血脑屏障形成中作用的初步研究英文题目：Atg7regulatestheexpressionoffibronectinanditsroleintheformationofblood-brainbarrier论文作者：班蒙指导教师：陈誉华教授学科专业：细胞生物学完成时间：2018年3月中国医科大学硕士学位论文Atg7调控纤连蛋白表达及其在血脑屏障形成中作用的初步研究Atg7regulatestheexp

2、ressionoffibronectinanditsroleintheformationofblood-brainbarrier论文作者班蒙指导教师陈誉华教授申请学位理学硕士培养单位基础医学院一级学科生物学二级学科细胞生物学研究方向神经血管生物学和血脑屏障论文起止时间2016年3月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月中国医科大学硕士学位论文摘要背景及目的血脑屏障（BBB）是由具有紧密连接结构的脑微血管内皮细胞（BMEC）、基膜、周细胞、星形胶质细胞（足突）共同构成的结构，其中基

3、膜在血脑屏障组装中起到不可或缺的作用。基膜主要由纤连蛋白（fibronectin,FN）、层连蛋白、Ⅳ型胶原、内肌动蛋白以及一些糖蛋白等组成，一般认为FN可介导基膜与周围细胞之间的黏附，对BBB的屏障作用的维持起着重要作用，但BBB基膜中FN的来源、表达调控机制及其在维系BBB中的详细机制，目前尚不清楚。近年来，不断增加的研究显示，细胞自噬参与了脑卒中的微血管病变过程，而且本人所在实验室的前期研究结果表明，细胞自噬的关键因子——自噬相关蛋白7（Autophagy-relatedprotein7,Atg7）在脑微血管发

4、育中起重要作用，但Atg7与BBB基膜成分的关系，迄今尚未见文献报道。本文的主要目的是：在观察脑微血管发育过程中FN表达变化的基础上，借助模式细胞（人脑微血管内皮细胞，HBMEC）和Atg7血管内皮细胞条件性敲除小鼠，探讨Atg7与BBB基膜的主要成分FN表达的关系，为进一步探讨BBB的稳态维持积累科学资料。实验方法一、脑微血管发育过程中FN的表达变化利用Westernblot检测脑发育过程FN的表达变化。二、利用血管内皮细胞Atg7条件性敲除小鼠，检测小鼠脑微血管内皮细胞中FN的表达和血脑屏障的通透性1.血管内皮细

5、胞Atg7条件性敲除小鼠的制备和鉴定。2.用Atg7条件性敲除小鼠和野生对照小鼠制作脑震荡切片。3.利用组织免疫荧光法检测内皮细胞中FN表达水平。4.小鼠腹腔注射伊文思蓝，利用组织免疫荧光法检测Atg7条件性敲除小鼠和野生对照小鼠血脑屏障通透性。三、应用模式细胞（HBMEC）研究Atg7与FN表达的关系I中国医科大学硕士学位论文1.构建Atg7稳定干扰的HBMEC（人脑微血管内皮细胞）细胞株和对照细胞株。2.用Real-timePCR，Westernblot以及细胞免疫荧光染色检测Atg7和FN的表达变化。四、Atg

6、7调控FN表达机制的初步研究以信号通路抑制剂处理HBMEC，利用RT-qPCR检测不同抑制剂处理后的FN表达水平，以及抗p65抗体的免疫荧光（检测p65入核）方法以确定参与Atg7调控FN表达变化的信号通路。实验结果一、小鼠脑内FN表达随时间减少利用westernblot检测出生后1、3、7、14、30、60天的小鼠大脑内FN的表达情况，结果显示：小鼠脑内FN表达的高峰出现在第14天，这与小鼠脑微血管发育的高峰期一致，提示脑内检测到的FN可能主要来源于脑微血管内皮细胞。二、在Atg7条件性敲除小鼠中，脑微血管内皮细胞

7、中FN的表达下降，血脑屏障通透性升高用四个月龄的内皮细胞敲除Atg7（Atg7-/-）的小鼠和同窝野生对照小鼠，制作振荡切片，组织免疫荧光染色检测Atg7在血管内皮细胞中的表达。结果显示：与野生对照小鼠相比，CD31定位内皮细胞，Atg7条件性敲除小鼠中，其FN荧光亮度显著降低。三、人脑微血管内皮细胞中，干扰Atg7导致FN表达降低1.用Real-timePCR检测Atg7稳定干扰细胞株和对照细胞的mRNA表达水平，结果显示：与对照细胞株相比，干扰Atg7的表达后，FN的mRNA表达水平显著降低。2.用Western

8、blot检测Atg7稳定干扰细胞株和对照细胞的总蛋白表达水平，结果显示：与对照细胞株相比，干扰Atg7表达后，FN的蛋白表达水平也显著降低。3.用细胞免疫荧光方法检测Atg7稳定干扰细胞株和对照细胞组分泌到胞外基质中的表达变化，结果显示：与对照细胞株相比，Atg7稳定干扰细胞株分泌到胞外基质的FN蛋白明显降低。四、NF-κB信号通路可能参与了A