人参皂苷rh2 对lovo 细胞迁移和转移能力的影响及机制讨论

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1、人参皂苷Rh2对LoVo细胞迁移和转移能力的影响及机制讨论　　我国结肠癌的发病率呈逐年上升的趋势，联合化疗和生物治疗有助于提高患者的5年生存率，然而，其药物本身的毒副作用极大限制了其应用范围。随着传统医学的复兴，越来越多的中药以及中药单体被应用于临床科学试验。人参皂苷Rh2是人参中分离提纯的一种单体，其在各种肿瘤的相关研究中有着较为显著的作用，研究表明：Rh2能有效抑制人肝癌细胞SMMC-7721、人结肠癌细胞Caco-2和HT-29、小鼠宫颈癌细胞U14、人食管癌细胞Eca-109、马立克氏病肿瘤细胞系MSB-1、人白血病多药耐药(MDR)细胞K562/V

2、CR的增殖，提高机体免疫力，引起肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤生长受到抑制。然而，针对人参皂苷Rh2对结肠癌转移的实验研究，目前尚无研究报道。　　目前，体外研究肿瘤细胞的转移能力主要采用Transwell实验。Transwell实验通过检测体外肿瘤细胞的迁移和侵袭能力来判断肿瘤细胞转移能力的高低。本研究拟采用Transwell实验检测人参皂苷Rh2对体外结肠癌LoVo细胞的迁移和侵袭能力的影响，并初步探讨其分子机制，现报道如下。　　1材料与方法　　1.1细胞和试剂　　人结肠癌细胞LoVo株由香港科技大学赠送;Rh2购自上海雅吉生物科技有限公司(Cat，纯度大于mg/

3、g)，溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成10mmol/L母液分装冻存备用;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司;胎牛血清、液体培养基RPMI-1640和细胞培养用g/L胰酶购自美国Gibco公司;胶原预包被的Transwell(CatNo.3422)购自美国Corning公司;兔抗人-Tubulin(BM1453)、-catenin(BA0426)、CD44(BA0321)、基质金属蛋白酶MMP2(BA3716)、基质金属蛋白酶抑制剂TIMP2(BA0576-2)和E-Cadherin(BA0475-2)抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。　　1.

4、2主要仪器　　BoxunSW-CJ-2F型双人双面净化工作台(中国上海博迅实业有限公司医疗设备厂);ThermoFisherScientific细胞培养箱(美国赛默飞世尔科技公司);MoticAE2000倒置显微镜(中国麦克奥迪实业集团有限公司);IX71荧光显微镜(日本Olympus公司);iMark680酶标仪(美国Bio-Rad公司);Bio-Rad电泳转膜仪(美国Bio-Rad公司)等。　　1.3MTT法测定　　不同浓度Rh2对LoVo细胞增殖的影响5103/孔LoVo细胞接种于96孔板内，完全培养基培养过夜，加入0、5、10、20、40、60mol

5、/LRh2分别处理24、48、72h，每个浓度做6个平行孔，采用酶联免疫检测仪于490nm处测取每孔的吸光度(D)值。　　1.4Rh2对LoVo　　细胞迁移的影响将细胞密度为5105个/mL的LoVo细胞铺于24孔板(每孔500L)上，加入含体积分数10%胎牛血清的RMPI-1640培养液，培养16~24h，使形成单层细胞，换成无血清培养基继续培养过夜;用200L移液枪枪头在单层细胞上呈一字划痕，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次;加入5、10、20、40、60mol/L无血清培养基配制Rh2溶液，平行2个样本，孵育24h，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。最后通

6、过计数爬入一字划痕空白区域内的细胞数来反映细胞的迁移能力。　　1.5Rh2对LoVo细胞转移的影响　　待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次;用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2105/mL，在24孔板(下室)加入600L含体积分数15%血清的培养基;上室用70L无血清培养基培养箱孵育3min，吸弃培养基后加入经过不同浓度的人参皂苷Rh2处理的100L细胞悬液;继续在孵箱培养24h，用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800L甲醇的孔中;室温固定30min，取出chamber，吸干上室固定液，移到预

7、先加入约800LGiemsa染液的孔中;室温染色30min，轻轻用PBS冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干;移至载玻片上，显微镜下随机取9个大小一致的视野计数，统计结果。最后通过计数穿膜细胞数来反映细胞的转移能力。　　1.6Westernblot检测　　CD44、MMP2、TIMP2、ECadherin和-catenin表达具体方法参见文献，对Rh2处理后的细胞进行裂解提取蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转印。转印好的聚偏二氟乙烯(PVDF

8、)膜封闭后依次加入相应一抗和二抗，膜入发光液中孵育后