重组人亲环素a的表达纯化-1104班吴敌

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1、综合实验：CyclophilinA的表达及纯化CyclophilinA的表达及纯化报告题目CyclophilinA的表达及纯化作者姓名吴敌班级学号1104班2011114020409指导教师张新潮完成时间2014年11月生物学实验教学中心1综合实验：CyclophilinA的表达及纯化重组人亲环素A(rhCyPA)的表达纯化吴敌（指导老师：张新潮）（湖北师范学院生命科学学院生物技术1104班湖北黄石435002）摘要：将亲环素A基因片段插人原核表达载体pET中,得到重组质粒pET-CyPA,转入大肠杆菌获得高效表达。重组有CyPA基因的大肠杆菌M

2、15在含有氨苄青霉素（100ug/ml）和卡那霉素（25ug/ml）的LB培养基中培养，当A600达到大约0.5时，终浓度为1mM的异丙基硫代–B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养6h，再经过收集菌体、离心、重悬、超声波破壁、离心后得到蛋白粗提液。蛋白粗提液经SephacryTMS-100分子筛层析和DEAE-SepharoseCL-6B柱层析得到纯化的重组人CyPA。关键词：重组人亲环素A;基因表达;层析;引言CyP18是最早发现的亲环素类蛋白，分子量为18000，也称CyPA，存在于细胞质、核膜及高尔基体中，具有亲环素家族的典型特征，是Cyp

3、s家族中最丰富的一种，约占细胞总蛋白的0.1%一0.4%[1]。人的CyP18由165个氨基酸组成，由X-衍射可知[2]，CyP18的主要二级结构以β-折叠为主，并伴有α-螺旋、β-转角及无规线团，8条反平行的β-折叠片段分别与环(Loop)和包埋于件折叠片段两端的3条α-螺旋相连接，形成一个右手R-桶型结构，内部形成疏水中心。亲环素A(CyclophilinACyPA)具有肤基脯氨酸顺/反异构酶(PPIase)活性和结合免疫抑制剂环抱素A的能力[3,4]。后来发现CyP是一个在进化上相当保守、功能相关的蛋白质家族,cyPA7综合实验：Cyclo

4、philinA的表达及纯化是这个家族中最主要的成员。近年发现全身性红斑狼疮等自身免疫病人体内存在抗CyPA自身抗体,检测CyP抗体有助于了解自身免疫病的发病机制和进行临床诊断[5].这些工作都需要大量纯化的人CyPA。用大肠杆菌体外表达人CyPA,能满足这些工作需要,避免了从人组织提取纯化的麻烦。此外,利用基因克隆表达技术还能进行定点突变,作为其结构、动力学和作用机制研究的辅助手段。本研究在对CyPA基因进行了克隆和序列测定的基础上,构建了表达载体,在大肠杆菌中获得高水平表达[6]。1.实验材料与试剂1.1实验材料c115a菌种（大肠杆菌）1.2

5、抗生素储备液氯苄青霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成100mg/mL氨苄青霉素（ampicillin，简称Amp）溶液，分装，-20°C保存备用。使用时每毫升培养基加入0.7～1mL，终浓度为70～100mg/mL。卡纳霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素（kanamycin，简称Kan）溶液，分装，-20°C保存备用。使用时每毫升培养基加入3～5mL，终浓度为30～50mg/mL。1.3IPTG储备液将2g异丙基硫代--D-半乳糖苷（isoprophylthio--D-galactoside，简称IPTG），溶于二次重蒸水中

6、，过滤除菌，分装，-20C保存备用1.4缓冲液不同浓度的Tris-Hcl缓冲溶液1.5SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳7综合实验：CyclophilinA的表达及纯化试剂用量12%Gel5ml双蒸水1.6ml30%丙烯酰胺2.0ml1.5MTris-Hcl（pH=8.8）1.3ml10%SDS0.0510%过硫酸铵0.05TEMED0.002浓缩胶（5%Acrylamide）1双蒸水1.430%Acrylamide0.331.0MTris-Hcl0.2510%过硫酸铵0.0210%SDS0.02TEMED0.02实验方法2.1活化菌种取洁净的试

7、管一支，加入6mlLB液体，并用10ul的枪头注入3ulkana以及6ulAmp这两种抗生素溶液后，再加入120ulc115a菌种，在37c下150r/min培养过夜2.2接种扩大培养100mlLB液体+100ulAmp+50ulKana+6ml菌液，在37c下180r/min培养3小时至OD值为0.5左右后加入100ulIPTG诱导物诱导，继续在37c下180r/min条件下诱导5-6小时后。2.3蛋白质提取将菌体培养液转移到250ml的大离心瓶中，在5000rpm条件下离心8分钟弃取上清液，并将5xTris-Hcl缓冲溶液（pH=7.8）稀释

8、到一倍体积后，加入30ml的1x缓冲液洗涤菌体，并转移到30ml的离心管中7综合实验：CyclophilinA的表达及纯化在装有碎冰的烧