传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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1、学校代码１０４５９学号或中请号２０１５１２１６２００８Ｖ密级公开ｋ％硕士学位论文传染性支气管炎病毒Ｎ蛋白单克隆抗体的制备及鉴定作者姓名：耿玥导师姓名：周景明副教授学科门类：理学专业名称：细胞生物学培养院系：生命科学学院１完成时间：２０８年５月Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterPreparationandIdentificationofMonoclonalAntibodyagainstNuc

2、leoprotionofInfectiousBronchitisVirusByYueGengSupervisor:AssociateProf.JingmingZhouMajor:CellBiologySchoolofLifeSciencesMay,2018摘要摘要传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病，是严重危害养鸡业的重大传染病之一。IBV是禽类一种变异性很强的冠状病毒，传播迅速、血清型众多，不同的血清型之间

3、缺乏交叉保护。IBV的蔓延对全球家禽业造成了严重的损失。N蛋白是诱导机体免疫应答的重要免疫原蛋白，N基因具有高度的保守性。本研究以IBVN蛋白为研究对象，制备了针对N蛋白的单克隆抗体，对IBV的预防、诊断及控制具有一定的意义。本实验将IBVH120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁，从含病毒的尿囊液中提取总RNA，反转录为cDNA。设计一对特异性引物对N基因进行扩增，片段大小为1230bp，将其与克隆载体pMD19-T连接并转入DH5α感受态细胞并保存菌种，将其与表达载体pGEX-6p-1连接并转入Transetta(DE3)感受态细胞，进行诱导表达。SDS-P

4、AGE电泳分析重组N蛋白大小约为79kD，用GST柱纯化重组N蛋白，加入PreScissionProtease切除GST标签，Western-blot检测N蛋白的抗原性，结果显示N蛋白有较好的抗原性。采用纯化的N蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，通过间接ELISA方法检测，选取免疫效果最好的小鼠B淋巴细胞进行细胞融合。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，经过三轮亚克隆获得了13株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株，其中8株能与IBV结合。选择效价高且能与IBV结合的1A12C5细胞株，通过小鼠体内诱生腹水法大量制备抗N蛋白的单克隆抗体，收集腹水用正

5、辛酸-硫酸铵法对其进行纯化，SDS-PAGE电泳结果表明该单抗纯度比较高。1A12C5单克隆抗体重链为IgG2b，轻链κ型。纯化后的1A12C5单抗效价可以67达到1:1.64×10，亲和力常数为1.87×10L/mol。特异性鉴定结果表明1A12C5仅与IBV特异性结合。1A12C5单克隆抗体能与不同血清型的IBV反应。稳定性鉴定表明1A12C5单克隆抗体具有良好的传代稳定性。本试验成功制备了13株抗IBVN蛋白单克隆抗体其中8株可以与IBV结合，为进一步研制IBV诊断试剂奠定了基础。关键词：传染性支气管炎病毒N蛋白原核表达单克隆抗体IAbstract

6、AbstractInfectiousbronchitis(IB)isanacute,highlycontagiousdiseasecausedbyinfectiousbronchitisvirus(IBV),whichisoneofthemajorinfectiousdiseasesendangeringthechickenindustryseriously.IBVisahighlyvariableaviancoronaviruswithrapidspread,numerousserotypesandlackofcross-protectionbetwe

7、endifferentserotypes.Nproteinisanimportantimmunogenthatinducesimmuneresponses.ThegeneofNproteinishighlyconserved.PreparationofmonoclonalantibodyagainstNprotionofIBV,whichhascertainsignificanceforthediagnosis,preventionandcontrolofIBV.Inthisstudy,IBVH120strainwasexpandedbyinoculat

8、ionofchickenembryosandtotalRNAwasextract