《发酵工程实验》

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1、实验一淀粉酶生产菌的筛选一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。二、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。三、实验用品1．样品淀粉含量丰富的土样。2．培养基肉汤培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，加水至1000ml，pH7.0。121℃灭菌20min。初筛平板培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加水

2、至1000ml，pH7.4。121℃灭菌20min。Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。3．器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，电子天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，移液管，洗耳球，试管，试管架，接种针，涂布棒。四、实验方法1．培养基制备：配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。2．倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却至50～60℃，以无

3、菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。冷却凝固待用。3．样品预处理：取5g土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。4．平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。5．菌株检测：待初筛平板长出菌落后

4、，根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。同时，将检测试剂（Lugol碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，记住其编号，以便进行下一步实验。6．保存菌种：将得到的菌株转接至斜面培养基上，30℃培养48～72h，待菌苔长好后，4℃保存。五、思考题微生物菌种的分离筛选通常包括哪几个部分？实验二淀粉酶酶活测定一、实验目的1．掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法2．从初筛所获得的菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株二、实验原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶

5、）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。α-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、含6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可以用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。三、实验用品1．粗酶液实验一保存的菌种进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。2．试剂碘原液：称取碘化钾

6、22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，贮于棕色瓶中；比色用稀释碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中；2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100ml，需当天配制；pH6.0的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；0.5mol/L乙酸溶液。3．器材离心机，分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表；试管，

7、移液管，烧杯，离心管。四、实验方法1．标准曲线的绘制：表2－1标准曲线的制作试剂管号123456淀粉稀释液浓度/%00.20.51.01.52.0淀粉稀释液/ml222222缓冲液/ml11111140℃水浴中保温5min蒸馏水/ml11111140℃水浴中保温30min，加入0.5mol/L乙酸10ml，混匀后吸取反应液1ml稀碘液/ml101010101010A660将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0ml，40℃水浴保温15min；加蒸馏水1ml

8、，40℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml；吸取反应液1ml，加入稀碘液10ml