心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定.doc

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1、心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定关键词】心作者：潘国栋黄永章，郭凌郧，唐俊明，孔霞，YANGQinglin，王家宁肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞[摘要]目的：构建并鉴定心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体（MHC-EGFP），该基因只在心肌中特异性表达。方法：设计5’和3’分别具有SalI/HindⅢ酶切位点的EGFP引物，聚合酶链反应法（PCR）从pLEGFP质粒中扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的cDNA，插入pGEM-TEasy载体表达盒，构建pGEM-EGFP，SalI/HindⅢ双酶切后回收7

2、29kb片断，插入经相同酶切的含5.5kb心肌特异性α肌球蛋白重链启动子的pNC26质粒，构建pMHC-EGFP。连接产物转化感受态DH5α，挑选克隆，PCR扩增鉴定，重组质粒经NotI酶切，回收7.2kbMHC-EGFP表达盒。分离培养小鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞。MHC-EGFP表达盒通过脂质体法分别转染心肌与骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜观察转染细胞是否出现绿色荧光，以鉴定MHC-EGFP表达盒是否具有表达特异性。结果：EGFPcDNA正确插入pNC26质粒中αMHC启动子3’端。成功转染MHC-EGFP表达盒的心肌细胞出现绿色荧光，而转染的骨骼肌成肌细胞无荧光出现。结论：

3、MHC-EGFP表达盒具有心肌特异性表达特性，为进一步监测干细胞向心肌分化研究奠定基础。[关键词]心肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞Abstract:ObjectiveToconstructandidentifythecardiac-myosinheavychainpromoter(MHC)-drivenenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)expressionvector(pMHC-EGFP),whichsolelyexpressesEGFPincardiomyocytes.MethodsEGFPcDNAprim

4、ersweresynthesizedwithforwardprimerandreverseprimercontainingSalIandHindⅢ,respectively.EGFPcDNAwasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR),addedsingledeoxyadenosineat3’ends,andsubclonedintopGEM-TeasyvectortoconstructpGEM-EGFP.Thefragmentof729bpfromSalI/HindⅢ-digestedpGEM-EGFPwassubclonedinto

5、pNC26,aplasmidcarried5.5kbMHCpromoter,toconstructpMHC-EGFP.Theexpressioncassetteof7.2kbMHC-EGFPwasrecoveredwithlowmeltingpointagaroseelectrophoresis.Mousecardiomyocytesandskeletalmusclemyoblastswereisolatedandculturedinvitro.MHC-EGFPexpressioncassettewastransfectedintocardiomyocytesandmyobl

6、asts,respectively.EGFPexpressionwasobservedunderfluorescentmicroscope.ResultsEGFPcDNAwassuccessfullyinsertedintothe3’endsofMHCpromoter.Thegreenfluorescencecouldbeobservedintransfectedcardiomyocytes,butnotintransfectedmyoblasts.ConclusionMHC-EGFPexpressioncassettecan5bespecificallyexpressedw

7、ithincardiomyocytes,whichprovidesabasistomonitorthedifferentiationofstemcellsintocardiomyocytes.Keywords:Cardiac-specific;Myosinheavychain;Promoter;Enhancedgreenfluorescentprotein;Stemcells　近年来日益兴起的大量干细胞研究证实，胚胎或成体间充质干细胞在一定条件下可以分化为心肌样细胞，为心脏疾病的治疗带来了希望。然而这些