从水蛭干燥全体提取水蛭素的工艺研究.doc

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1、从水蛭干燥全体提取水蛭素的工艺研究【摘要】目的确立水蛭的提取工艺。方法通过实验确定提取的最佳工艺，以水蛭素含量为指标评价该工艺。结果提取水蛭的最佳工艺为:70%～80%的乙醇，温度在60℃，提取时间1.5h。结论该工艺适于水蛭的提取。【关键词】水蛭水蛭素提取［Abstract］ObjectiveToestablishtheextractiontechnologyofhirudo.MethodsExperimentwasappliedtoestablishtheoptimumextractiontechnology，asguideline，thecontentsofhirudin

2、wasusedtoevaluatethetechnology.ResultsTheoptimaltechnologywasasfollows:ethanol70%～80%，temperature60℃，extractiontime1.5h.ConclusionThetechnologyisgoodforhirudoextraction.［Keywords］hirudo;hirudin;extraction水蛭（Hirudo）为水蛭科动物蚂蟥（WhitmaniapigraWhitman）、水蛭（HirudonipponicaWhitman）或柳叶蚂蟥（Whitmaniaacran

3、ulataWhitman）的干燥全体，具有破血、逐瘀、通经作用，用于癥瘕痞块、血瘀经闭、跌扑损伤［1］治疗。作为常用的活血化瘀中药，水蛭在临床广泛用于脑血栓、冠心病、脑水肿等疾病的治疗，其有效成分主要为一种抗凝血物质，名为水蛭素（Hirudin）。它能阻止凝血酶对血小板的作用，抑制血小板受凝血酶的刺激而释放，从而延缓或阻止血液的凝固［2］。研究表明，水蛭素是由65个氨基与3个二硫键组成的多肽，分子量约为7000［3］，在干燥状态下稳定存在;室温下，在水中稳定存在6个月，80℃下加热15min不被破坏;提高溶液的pH值，其稳定性下降;20℃下，在0.1mol/L的HCl或NaOH

4、中可稳定15min［4］。水蛭素与凝血酶的亲和力极强，1μg水蛭素可中和5μg凝血酶，相应摩尔比为1∶1，即中和一个国际单位（NIH单位）的凝血酶需要一个抗凝单位（IAT-u）的水蛭素。根据以上摩尔比，以水蛭素含量为指标，对不同浓度、温度及提取时间的水蛭提取物进行比较，选择最佳工艺路线，并确定水蛭提取制备工艺。1材料与方法1.1实验材料1.1.1仪器SIGMA单道移液器；RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣公司）；Sigma4K15高温冷冻离心机；自动酸碱滴定仪DL53MettlerToledoSwitzerland。1.1.2药物与试剂水蛭购于北京松兰中药饮片有限公司，经北京松

5、兰中药饮片公司主任中药师蔡长德鉴定为水蛭科动物蚂蟥干燥全体；纤维蛋白原（Fibrinogen）:SIGMA;凝血酶（Thrombin）:SIGMA。31.2实验方法1.2.1水蛭素的测定方法取纤维蛋白原0.25g，溶于50ml的Tris-HCl缓冲液（pH≈8）中，得0.5%的纤维蛋白原溶液。稀释凝血酶到5NIH/ml。取0.2ml纤维蛋白原溶液，加入20μl水蛭素提取液，并加入凝血酶至凝固，得水蛭素含量=（凝血酶浓度×凝血酶用量）/水蛭素提取液体积。1.2.2乙醇浓度的选择称取水蛭粗粉10g，分别用不同浓度的乙醇进行提取，乙醇的含量为0，30%，50%，70%，90%，提取温

6、度定为60℃，提取时间1.5h，过滤，回收乙醇，样品定容为25ml。分别测定样品中水蛭素含量。水蛭素的测定可依据其与凝血酶按1∶1结合的原理，采用以上方法测得。1.2.3温度条件的选择由于水蛭素只能在80℃下稳定存在15min，所以在选取温度时，应尽量避免温度过高造成水蛭素失活。所以本实验选用在50℃，60℃，70℃下分别进行。称取水蛭粗粉10g，采用70%的乙醇于3个温度各提取1.5h，并采用同样的方法测定水蛭素含量。1.2.4提取时间的选择称取水蛭粗粉10g，用70%的乙醇，在60℃下分别提取1h，1.5h，2h。分别测定提取样品的水蛭素含量。2结果2.1乙醇浓度的选择从表

7、1的数据可以看出，不同浓度的乙醇对水蛭的提取效果有较大的影响。从水蛭素的含量来看，随乙醇浓度的提高，其含量不断增加，在70%~80%的乙醇浓度下，获得较好的提取效果。由于水蛭素是一种可溶于水和乙醇等有机溶剂的蛋白质，所以综合两种因素考虑，70%~80%的乙醇浓度是较好的提取浓度。表1不同浓度乙醇的提取结果2.2提取温度的选择见表2。表2不同温度的提取结果2.3提取时间的选择见表3。表3不同提取时间的提取结果3小结本实验过程利用了水蛭素和凝血酶1∶1的配比关系，测定不同条件水蛭提取液的水蛭素含