尿脱落细胞端粒酶催化亚基mRNA检测在膀胱癌诊断和监测复发中的意义.doc

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1、尿脱落细胞端粒酶催化亚基mRNA检测在膀胱癌诊断和监测复发中的意义作者：柯尊金，丁心喜，朱伟，孙波　曾甫清【摘要】目的探讨尿脱落细胞端粒酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)mRNA检测在膀胱癌早期诊断和监测复发中的应用价值。方法采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasePCR,RT-PCR)检测42例膀胱癌、38例膀胱良性疾病患者和12例健康体检者晨尿中脱落细胞hTERTmRNA的表达，并与尿脱落细胞学检查结果比较；随访观察其

2、中37例膀胱癌术后尿液hTERTmRNA变化与复发的关系。结果hTERT检测膀胱癌的敏感性为97.62%，显著高于尿脱落细胞学检测的61.9%(P<0.05)；特异性为96%，与尿脱落细胞学检测98%无明显差异(P>0.05)；膀胱癌患者术前hTERTmRNA表达强度明显高于膀胱良性疾病患者和对照组(P<0.05)；且随肿瘤恶性程度的增加逐渐升高，G1、G2、G3(WHO分级)患者hTERTmRNA表达强度分别为0.63±0.14、0.75±0.16、0.87±0.20。结论尿脱落细胞hT

3、ERTmRNA检测具有高度敏感和特异性，对膀胱癌早期诊断、疗效评估和术后监测复发具有重要的临床应用价值。【关键词】膀胱癌；端粒酶催化亚基；尿脱落细胞；逆转录聚合酶链反应膀胱癌是泌尿系统最常见、易复发的肿瘤，目前缺乏理想的无创性早期诊断、监测复发的方法。我们采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasePCR,RT-PCR)检测端粒酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)mRNA在膀胱癌患者、膀胱良性疾病患者和健康者尿脱落细胞中的表达，

4、并与尿脱落细胞学检查结果对比，探讨其在膀胱癌早期诊断和监测复发中的应用价值。1资料与方法1.1临床资料膀胱癌患者42例，来自2004年3月至2005年9月于湖北老河口市第一医院和华中科技大学同济医学院附属协和医院就诊患者，男24例，女18例，年龄34-75岁，均经病理检查确诊为膀胱移行细胞癌，根据WHO分级标准，其中G113例，G219例，G310例。膀胱良性疾病患者38例，来自上述两所医院，男26例，女12例，年龄25-76岁，包括良性前列腺增生症12例，腺性膀胱炎11例，膀胱乳头状瘤8例，膀胱结石7例。

5、健康对照12例，来自健康体检者，男7例，女5例，年龄18-31岁。1.2主要仪器和试剂PCR仪(Biometram)购自德国Biotron公司，紫外分光仪(GeneQuant)购自美国Beckman公司，凝胶成像系统GDS8000型购自英国UVP公司。Trizol试剂和AMV逆转录酶购自美国promega公司。hTERT引物序列参考文献［1］，上游引物：5′-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3′,下游引物：5′4-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3′；β-actin上游引物：5′-ACAC

6、TGTGGCCATCTACGAGGGG-3′,下游引物：5′-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTT-CGTGGAT-3′；均由上海Sangon生物工程公司合成。TaqDNA聚合酶购自武汉大风生物科技有限公司。1.3方法1.3.1标本收集和制备留取受试者清晨第一次中、后段尿液，静置，弃上清，离心，生理盐水洗涤，取少许沉渣涂片行细胞学检查，余沉渣备总RNA的提取。1.3.2总RNA提取严格按Trizol说明从尿沉渣脱落细胞中提取总RNA，用紫外分光仪检测A260/A280比值，计算总RNA纯度。1.3.

7、3RT-PCR用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。逆转录制备cDNA，总反应体系20μL，按顺序加DEPC处理水、5×Buffer4μL、2.5mmol/LdNTP4μL、oligo(dT18)50pmol、Rnasin(40U/μL)0.5μL、总RNA2μg、AMV逆转录酶(9U/L)1μL，37℃反应1h，99℃5min终止反应，-20℃保存。PCR反应体系50μL，包括等量逆转录反应产物4μL，β-actin及hTERT的寡核苷酸引物5pmol，2.5mmol/LdNTP4μL，10×PCR反应缓冲

8、液5μL，TaqDNA聚合酶1.5U，PCR循环参数为94℃45s，57℃45s，74℃60s，35个循环。阴性对照中以灭菌水代替cDNA。2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定分析PCR扩增产物。hTERT产物长度145bp。β-actin反应体系与hTERT同管进行，产物长度208bp。凝胶分析软件计算目的条带灰度值。1.3.4尿脱落细胞学检查采用瑞氏-姬姆萨复合染色法，以正常膀胱移行细胞形态对照。病理分级标准(WHO)