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1、第34卷第3期 2004年9月工业微生物IndustrialMicrobiology Vol.34No.3 Sept.2004基金项目:福建省青年科技人才创新项目(编号2002J044)和厦门大学自选课题作者简介:何宁(1974～),女,博士,讲师。联系电话:0592-2183088;E-mail:hening@xmu.edu.cn生物絮凝剂高产菌株的选育何 宁1, 吴海军2, 邓 旭1, 卢英华1, 孙道华1, 李清彪1(1.厦门大学化学工程与生物工程系,厦门361005;2.亨氏美味源食品有
2、限公司,广州511483)摘 要 以野生菌谷氨酸棒杆菌CorynebacteriumglutamicumCCTCCM201005为出发菌株,进行紫外和甲基磺酸乙酯逐级诱变,获得一株絮凝剂高产菌XMU2YH1111,通过条件优化实验,获得突变株XMU2YH1111合成生物絮凝剂的最佳发酵条件:葡萄糖为碳源,尿素和酵母膏为氮源,培养基初始pH4～8,种子最佳种龄16h,接种量5%,发酵罐通风量1L/(L·min),搅拌转速100r/min。在此发酵条件下,絮凝活性最高可达到892U/mL,比原出发
3、菌株CCTCCM201005的絮凝活性提高2倍以上。关键词:生物絮凝剂; 谷氨酸棒杆菌; 诱变; 发酵 生物絮凝剂因其无毒无害、可生物降解等优点,在废水处理、食品工业、化工及生物制药等行业具有广泛的应用前景。然而,产量低、成本高仍然是目前限制生物絮凝剂在实际应用中进行推广的主要问题[1]。近年来,国内外学者为提高生物絮凝剂产量、降低成本,先后在微生物絮凝剂产生菌的筛选、发酵条件优化等方面进行了广泛研究,但效果并不显著,提高产量仍然是生物絮凝剂研究者目前首要解决的问题[1,2,3]。 在前期的
4、研究工作中,作者从土壤中筛选得到的一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutam2icum)CCTCCM201005,该菌能够以葡萄糖或蔗糖为碳源合成一种以半乳糖醛酸为主要结构单元的新型生物絮凝剂REA211[4,5]。为提高该菌株合成REA211的产量,本文尝试采用传统的物理化学诱变方法来对原有的絮凝剂产生菌株进行改造,以期从根本上提高菌株合成絮凝剂的能力,获得絮凝剂高产变异株。1 材料和方法1.1 菌种 CorynebacteriumglutamicumCCTCCM20100
5、5,保藏于武汉中国典型培养物保藏中心。1.2 培养基1.2.1 斜面培养基(g/L) 葡萄糖5,酵母膏1,牛肉膏1,胰蛋白胨2,硫酸亚铁微量,琼脂15～20。1.2.2 种子培养基(g/L) 葡萄糖10,酵母膏0.5,磷酸二氢钾0.1,尿素0.5,氯化钠0.1,七水硫酸镁0.2。1.2.3 发酵培养基(g/L)碳源10,氮源1,磷酸二氢钾0.1,氯化钠0.1,硫酸镁0.2。1.2.4 筛选培养基(g/L) 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)10(mL),酵母膏0.5,磷酸二氢钾0.1,尿素0.5,
6、氯化钠0.1,七水硫酸镁0.2。 以上培养基pH均为8.0。1.3 培养方法1.3.1 种子培养 于新鲜斜面取一环菌,接入种子培养基(100mL/250mL三角瓶),28℃,120r/min振荡培养16h。1.3.2 摇瓶培养 将培养16h的种子液以5%(v/v)的接种量接入发酵培养基(100mL/250mL三角瓶),28℃,120r/min振荡培养48h。1.3.3 小罐分批培养—7— 以5%(v/v)的接种量将种子培养液接入装有2L发酵液的3L发酵罐中,通气量为1L/(L·min),
7、搅拌转速100r/min,28℃,溶氧在线自动检测。1.4 诱变方法1.4.1 紫外诱变方法 于新鲜斜面取一环菌接入种子培养基(100mL/250mL三角瓶),28℃、120r/min培养16h,离心收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体三次,制成菌体浓度约为107个/mL的单细胞菌悬液,将此单细胞菌悬液于紫外灯下照射60s后,按5%的接种量接至发酵培养基中,28℃、120r/min暗室培养过夜,按稀释法涂布于筛选平板上,28℃恒温培养至菌落生长良好,挑取菌落进行筛选。1.4.2 甲基磺酸乙酯(EM
8、S)诱变方法 于新鲜斜面取一环菌接入种子培养基(100mL/250mL三角瓶),28℃、120r/min培养16h,离心收集细胞,用无菌生理盐水和0.1mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)各洗涤一次后,将打散的菌体悬浮于含有10g/L甲基磺酸乙酯(EMS)的0.1g/L磷酸钾溶液(pH7.0)中,28℃振荡处理1h。取10mL处理后的菌悬液用0.16mol/L硫代硫酸钠溶液稀释10倍终止反应,离心收集菌体,用无菌生理盐水洗涤后接入新鲜的种子培养基中进行后培养。最后取后培养液按十倍稀释涂筛选平
