最新_现代实验动物学技术

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1、现代实验动物学技术招霞现代实验动物学技术试管动物培育技术转基因动物培育技术胚胎工程技术克隆动物培育技术一、试管动物培育技术定义（testtubeanimal）经体外受精获得早期胚胎后移植到假孕动物输卵管或子宫发育而产生的动物。意义进行发育生物学的研究克服动物生殖缺陷提高动物繁殖力定向培育新品种试管动物培育程序精子卵子体外受精假母胚胎培养胚胎移植产仔二、转基因动物培育技术转基因动物（transgenicanimal）定义指基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗传的一类动物是借助基因工程技术，将特定的外源基因

2、导入配子、受精卵或早期胚胎细胞，并整合到受体染色体基因组中，外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中，并遗传给后代二、转基因动物培育技术只有当外源基因整合入生殖细胞，才能遗传给子代。嵌合体动物（chimericanimal)只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体雄原核显微注射法制备的动物第一代中1-10％为嵌合体（延迟整合）二、转基因动物培育技术意义探讨基因功能及调控机理建立人类疾病动物模型人类疾病的基因治疗改良、培育动物新品种研制、生产生物活性物

3、质tPA（组织型溶纤蛋白原激活因子）人血红蛋白转基因猪外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列作用调控基因表达常是多基因相互作用的结果在某一发育阶段，某一基因的表达可能开始于另一基因的关闭，因而基因表达受到组织特异性和时空的调控只有通过转基因动物才有可能研究基因表达、调控和基因间的相互作用supermice二、转基因动物培育技术雄原核显微注射法逆转录病毒感染法胚胎干细胞介导法精子载体导入法二、转基因动物培育技术逆转录病毒感染法受精卵四细胞胚囊胚原肠胚原核注射法胚胎干细胞法（一）雄原核显微注射法方法借助显微操

4、作仪，将毛细玻璃管针直接插入受精卵的雄原核内，把纯化的目的基因（DNA）注入其中，再移植到受体进一步发育。步骤取卵目的基因的制备显微注射卵移植目的基因的检测建系（一）雄原核显微注射法优点实验过程简化任何DNA可直接导入原核内，且长度可达50kb大多数情况下，外源DNA在卵裂前与受体基因组整合，可分布在所有组织细胞中（一）雄原核显微注射法缺点设备昂贵,技术要求高对卵子损伤大，胚胎存活率低有些动物的原核看不清楚，需经特殊处理才能有效导入基因整合的随机性（引起宿主基因序列重排、缺失、重复、异位，或不插入，呈游离

5、状态，以质粒形式存在）外源基因常以多拷贝串联形式整合，导致该区域异染色质化，使转基因沉默（一）雄原核显微注射法注意情况整合拷贝数1-100左右，多拷贝常以首尾相联的形式存在，建系过程中随代数增加，拷贝数降低整合位点单一整合是随机的基因表达强弱不一定与拷贝数正相关，可能与位置效应有关（二）逆转录病毒感染法方法以逆转录病毒作载体，把外源目的基因克隆到载体中，将此重组DNA利用包装细胞包装成高感染滴度的病毒颗粒，用共培养法感染发育早期的胚胎，将外源基因导入宿主染色体内。（二）逆转录病毒感染法优点无需昂贵设备避免

6、注射法对卵子造成的伤害宿主范围广可同时感染大量胚胎，感染率高，胚胎存活率高常为单拷贝整合（二）逆转录病毒感染法缺点病毒载体容量不大，导入外源基因大小受限，为10-15kb整合位点随机，整合率不高受体为多次卵裂后的早期胚胎，使外源基因在动物组织分布不均，不易整合到生殖细胞重组逆转录病毒不稳定，外源基因易重排或丢失病毒DNA序列可能会干扰外源基因的表达，其长末端重复序列（LTR具转录启动子活性）的甲基化状态常使导入基因的表达缺如逆转录病毒的致癌性某些胚胎的自我保护机制对逆转录病毒入侵的有抗性比较显微注射逆转录

7、病毒DNA长度<50kb<10-15kb时相受精卵（单细胞）4-16细胞卵整合方式随机、多拷贝随机、单拷贝表达受宿主旁侧受LTR甲基化影响DNA影响易缺如传代可以只有整合至生殖细胞者可传代（三）胚胎干细胞介导法胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES)是从囊胚期胚胎的内细胞团分离出来的一种高度未分化具多向发育潜能的细胞即可进行体外培养，又可与早期胚胎聚集，参与宿主胚胎的发育（三）胚胎干细胞介导法方法分离培养ES细胞，体外导入外源基因，再移入同期胚胎成嵌合胚胎，发育成嵌合体动物在ES细胞上的基因

8、操作：可通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源目的基因导入ES细胞（三）胚胎干细胞介导法囊胚腔注射法步骤分离培养ES细胞ES细胞基因操作囊胚期胚胎移植囊胚腔注射嵌合胚嵌合体动物（三）胚胎干细胞介导法优点外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞的鉴定和筛选方便（三）胚胎干细胞介导法缺点ES细胞系建立及培养困难维持