土壤中分解尿素的细菌的分离与计数导学案

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1、土壤中分解尿素的细菌的分离与激素1、尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。2、CO(NH2)2+H2O细菌脲酶CO2+2NH3一、研究思路（一）筛选菌株1、实例----耐高温DNA聚合酶的寻找美国科学家布鲁克（1966年）--在美国黄石公园的一个热泉中发现耐热细菌。这说明寻找菌株要到期相应的中寻找。2、实验室中微生物的筛选原理人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方

2、法，或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。思考：1、该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？碳源：葡萄糖、尿素氮源：2、此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？能。只有产生脲酶的细菌才能利用作为氮源而生存。3、筛选菌株的培养基KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。4、选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止

3、其他种类微生物生长的培养基。思考：1、1个菌落1个活菌。2、统计的菌落数实际活的细菌数。3、用稀释涂布平板法一定要重复实验，一般至少要涂布3个平板。4、重复实验结果中小于30菌落的不用。（二）、统计菌落数目：1、活体计数法----稀释涂布平板法（1）操作方法：稀释涂布平板→统计菌落数。（2）原理：1个菌落→1个活菌。（3）统计原则①、选30∼300个菌落的平板统计。②、每个稀释度取3个平板取其平均值。（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目，因此统计结果一般用表示。每克样品中的菌株数=。C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；

4、M:稀释倍数。2、显微镜直接计数（三）设置对照1、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。2、对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养实验组：对照组：设置对照----同等条件下，培养空白培养基。4四、实验设计（一）土壤取样 1、土壤是天然培养基----其微生物数量、种类。2、土壤取样：（1）取样的位置：土壤中70∼90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。（2）取样要求：铲去表层土。（

5、1）、测细菌数：一般用104、105、106稀释液。（二）样品稀释（2）、测放线菌：一般用103、104、105稀释液。原则：确保平板上的菌落数在之间。（3）、测真菌数：一般用102、103、104稀释液。1、接种：用适当的稀释液作涂布平板2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d；（三）微生物的培养与观察放线菌:25∼28℃,5∼7d；霉菌:25∼28℃,3∼4d。3、观察：a.每24h统计一次菌落数目。原因：不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落

6、的数目。b.以“稳定菌落”为观察对象。原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。（四）鉴定酚红鉴别培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→结论：该细菌能分解尿素。注意：1、在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。2、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。五、实验的具体操作（一）、无菌操作1、土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右

7、，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。2、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。注意①、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②、为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③、统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。④、涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左

8、右为最好。3、样品的稀释：4（1）、应在火焰旁称取土壤10g。将称