反应分离耦合技术生产ｌ－苹果酸工艺过程优化及酶反应动力学的研究

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1、反应分离耦合技术生产工一苹果酸工艺过程优化及酶反应动力学的研究胡永红欧阳平凯陈武领蔡兴怀(南京化工大学生物工程与科学系南京210009)摘要研究了采用游离延胡索酸酶，利用生轴反应分离耦舍原理，富马酸钙为底物，在延胡素酸酶的作用下，直接生成苹果酸钙．_ii法相对目前广泛采用的固定化方法具有工艺流程短．操作简便．转化率及收率高等特点．研究结果表明．在转化温度为40'c、pit为7．o一7．5时，每升酶延胡索酸酶洼能在20一28h间将3．2kg的言马赣钙转化生成苹果酸钙，其转化率高速99．9％．富马酸在产品中的残留在0．1％左右，谊工艺生产出的上一苹果酸产品符合美国药其标准

2、，成本于化学合成法生产的雎一苹果酸相当．对反应分离耘舍过程中延胡索酸■罐化动力学进行研究，以旦￡2』旦对——L作图为一条直线，这说明t反应体系的反应速率符告米氏方程，并计算出C。一c。c。一c，相压的动力学参数．关键词苹果酸反应分再耦夸延胡索酸尊生物反应和产物分离过程耦合可以实现高底物浓度的发酵或酶转化，消除或减轻产物对生物催化剂的抑制，增加反应速率。同时，还可以起到降低产物分离能耗、简化产物分离过程、降低生产成本的作用，具有十分广阔的应用前景。作为近年来兴起的这一集反应过程和产物分离过程于一体的新颖技术理论。在研究过程中，将该技术应用于三一苹果酸生产中，取得了重大突

3、破。富马酸钠在延胡索酸酶的作用下，转化生成苹果酸钠是典型的可逆反应，转化率为70％～80％，反应液中苹果酸含量为10％f一”，虽然采用优化的高浓度富马酸铵体系，可以提高转化率达踮％～90％，酶转化液中苹果酸含量达20％[41，较普通采用的富马酸钠体系提高了一倍。随着反应分离耦合研究的不断发展，能否采甩该法生产￡一苹果酸?本文探讨了反应分离耦合技术在生产￡一苹果酸中的应用。巧妙地运用了溶解度的差别．在游离延胡索酸酶的催化下，将生物反应过程中生成的￡一苹果酸钙盐不断地从溶液中析出，反应不断地向着生成产物的方向移动，反应转化率高达99．9％，对富马酸钙的转化量达320％‘W

4、／V)，大幅度提高目的产物在酶转化液中的浓度，显著降低分离成本。同时，该分离耦台技术亦成功地应用于上一丙氨酸的生产中，转化率达100％．对天门冬氨酸的转化量可达260％(W／V)，产品浓度提高了，生产成本明显降低。当然在其他产品诸如对羟基苯甘氨酸，￡一苯丙氨敬生产过程中亦可使用该反应分离耦合技术，提高收率、降低成本。1材料与方法1．1试剂富马酸，工业级，苏州合成化工厂。碳酸钙，工业级，泗联化工厂．

5、{_l1．2菌株本文所用的菌株为产氨短杆菌MA一2(BrevibacteriumammoniagenesMA--2)和黄色短杆菌MA一3(Brevibacterium／la

6、vumMA--3)。1．3培养基组成1．3．1斜面培养基上述两株菌均于普通肉汤培养基中培养，其成分为：蛋白胨1％，牛肉膏0．s％，氯化钠0．5％，pH为7．0。1．3．2产氨短杆菌MA一2发酵培养基成分柠檬酸氢二铵3％，KH2P04o．撕，MgS04·7H20o．05％，玉米浆4．5％，用30％NaOH调节pH至7．5左右，灭菌后各用。1．3．3黄色短杆菌MA一3发酵培养基成分丙二酸2％，KH2P04o．2％，MgS04·7r1200．05％玉米浆2％用30％NaOH调节pH至75左右，灭菌后皤用。1．4培养条件-产氨短杆菌MA一2(丑ammoniagenesMA--

7、2)于32～34"C下培养24～36h，摇瓶接种量为10％，摇床转速180r／min，工业化生产中．按800I-发酵罐计，接种量为0．5％～l％黄色短杆菌MA一3(B加v"lMA一3)培养温度为30～32"C．其余条件同产氨短杆菌MA一2。1．5仪器DU650分光光度计(Beckman)。MDl00--2电子分析天平(上海第三分析仪器厂)。JJ—l一型定时电动搅拌器(金纭国华仪器厂)。HH司14一型电热恒温水浴锅，(常州国华仪器厂)。1．6分析方法：富马酸含量的测定详见文献【2】。苹果酸含量的测定详见文献【3l。2生物反应与分离耦合生产工一苹果黢过程及原理传统的￡一苹

8、果酸生产工艺即审内外普遍采用贲勺固定化延胡索酸酶生产工艺是将底物富马酸配成富马酸钠或富马酸铵j在延胡索酸酶的作用下进行水合，生成相应的苹果酸盐，反应式如F：矗lmaraseNa2Fu[或(Nil4)2凡]+H20——N≤2IIa[或(眦)2Ma]由于该反应是可逆的，通常富马酸钠盐转化体系平均转化率为70％～80％，富马酸铵盐体系转化率在88％--90％，产物浓度在10％～20％，还需进行“转晶”等工艺处理方能获得合格的产品，分离成本高，消耗大量原辅材料。基于上述原因及近年来反应分离耦合原理在乙醇、乳酸、o一干扰素等产品中成功地运用，现利用该原理．把生