（新编）实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定

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1、实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定标准依据：GB/T19857—2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一、实验目的：学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachitegreen）、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(Leucocrystalviolet)残留量的高效液相色谱的测定方法。二、实验原理：试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。三、实验试剂与仪器：（一）试剂(除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸

2、馏水。)乙腈：液相色谱纯。二氯甲烷。甲醇：液相色谱纯。乙酸盐缓冲液：溶解4.95g无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950mL水中,用冰乙酸调节溶液pH到4.5,最后用水稀释到1L。20%盐酸羟胺溶液。1.0mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL。50mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。二甘醇。酸性氧化铝：80-120目。二氧化铅。硅藻土545：色谱层析级。标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于98

3、%。标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100µg/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1µg/mL的标准溶液。-18℃避光保存。混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。-18℃避光保存。（二）仪器和设备1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。2、匀浆机。3、离心机：4000r/min。4、固相萃取装置。5、25%PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm´4mmi.d)，两端附2mm过滤板，抽真空下，填装含有25

4、%PbO2的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将PbO2氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间。6、酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。四、实验步骤:（一）样品制备提取称取5.00g样品于50mL离心管内，加入1.5mL20%的盐酸羟胺溶液、2.5mL1.0mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10000r/min的速度均质30s，加入10mL乙腈剧烈震摇30s。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30s。3000r/min离心10min。把上清液转移至装有10mL水和2mL二甘醇的100mL

5、离心管中。然后在50mL离心管中加入10mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。净化在离心管中加入15mL二氯甲烷,振荡10s，3000r/min离心10min，将二氯甲烷层转移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100mL梨形瓶中。45℃旋转蒸发至约1mL，用2.5mL乙腈溶解残渣。将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5mL,把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干，残液准确用0.5m

6、L乙腈溶解，过0.45μm滤膜，滤液供液相色谱测定。（二）色谱分析1、液相色谱条件a)色谱柱：C18柱，250mm´4.6mm（i.d.），粒度5μm，在C18色谱柱和检测器之间连接25%PbO2氧化柱;b)流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液(3.2.7),梯度洗脱参数见表1；c)流速：1.0mL/min；d)柱温：室温；e)检测波长：618nm(孔雀石绿);588nm(结晶紫)；f)进样量：50μL。流动相梯度表时间（min）乙腈,%乙酸铵缓冲溶液,%060404802015802015.19551795517.160402060401、液相色谱测定根据样液

7、中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、18.22min，标准品色谱图参见附录A中图A.2。空白试验：除不加试样外，均按上述测定步骤进行。五、计算结果与讨论：结果计算和表述按式（2）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结果需扣除

8、空白值。C´A´VX=……(2)As´W式中：X----样品中待测组分残留量，m