食物中维生素b12的测定方法

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1、食物中维生素B6的测定方法微生物法1.原理维生素B6在酸性介质中对热比较稳定，但在碱性介质中对热不稳定。测量维生素B6比较经典的方法是"微生物法"它的优点是：1.特异性高、精密度好、操作简单（不需要特殊设备，易于推广，样品不需要进行一系列的提纯步骤）、准确度高。它的缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。2.适用范围GB/T17407-1998，适用于药物、食物及饲料的检测3.仪器电热恒温培养箱电热手提式压力蒸汽消毒器液体快速混合器离心机722光栅分光光度计硬质玻璃试管4.试剂（1）0.22mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入12.32mlH2SO4，用水稀释

2、至1000ml。（2）0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28mlH2SO4，用水稀释至1000ml。（3）10mol/L氢氧化钠：溶200gNaOH于水中，稀释至500ml。（4）0.1mol/L氢氧化钠：取10ml10mol/LNaOH，用水稀释至1000ml。（5）溴甲酚绿：0.04%溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。（6）培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100ml蒸馏水中。（7）100ug/ml吡哆醇标准储备液：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于

3、1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，稳定1个月。（8）1ug/ml吡哆醇标准中间液：，取1ml吡哆醇标准储备液，稀释至100ml。（9）琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100ml。（10）1.5MOL/l生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。5.菌种的制备与保存5.1储备菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌ATCCNo.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时，取出后置于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存两周以上的菌种，不能立即用作制备接种用的种子液，一定要在使用前每天移种一次，连续2~3天，方可使用

4、，否则生长不好。5.2种子培养液的制备：加0.5ml50ng/ml的VB6标准应用液于尖管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）151b压力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。6.操作步骤整个步骤要避光（1）样品制备：取样0.5~10g（VB6含量不超过10ng）放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。放入高压蒸汽锅121℃下水解5个小时，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。（指示剂由黄-黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸

5、馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液即样液于冰箱内备测定（保存期不超过36小时）。（2）接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时接种两管，在30±0.5℃的恒温箱中培养18-20小时。取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。3.样品标准曲线的测定：取标准储备液2ml稀释至200ml成为中间液，从中间液中取5ml稀释至100ml作为工作液，浓度为50ng/ml，3组试管各加0，0

6、.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。（3）试样的测定：在试管中分别加入0.05，0.10，0.20ml样液，再加入5ml吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃，15磅/英寸2）高压10min，冷至室温备用。（4）接种和培养：每管接种一滴接种液，于30±0.5℃恒温箱中培养18-22小时（5）测定：从恒温箱中取出后，用722分光光度计测量，用空白管调零。550nm波长下，测定各管的吸光度值，以标准管所含VB6的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制VB6标准工作曲线，用测定管得到的吸

7、光度值，在标准曲线上查到测定管内所含VB6的量。7.计算各样管的吡哆醇含量A为：A（ng/ml）=（x1/V1+x2/V2+x3/V3）/3则样品的吡哆醇含量为：mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104每个样品各测定管的吡哆醇含量为x1，x2，x3；取液量分别为V1，V2，V3样品重W（g）取液量V（ml），定容至100ml8.注意事项（1）所有步骤需要避光处理（2）培养时每管必须在同一温度，培养时间以18-24hour为