反胶束萃取技术分离胰激肽原酶

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2、国家重点实验室生物7-程系上海200237)摘要研究了用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/正己醇/正辛烷反胶束溶液萃取和反萃取商业用胰激肽原酶时,水相pH值,离子强度和种类,CTAB浓度和助表面活性剂浓度等因素对分离效率的影响,并从反胶束微观结构给予解释.结果表明:[CTAB]=0.02mol/L,正己醇/正辛烷(V/V)=1:5,萃取pH=9.0,反萃pH=7.0,萃取[KBr]=0.1mol/L,反萃[KBr]=1.5mol/L,反萃取加15%乙醇(v/V)时,萃取率接近100%,反萃取活性回收得率在80%以上.商业用酶的纯化倍数最高为1.97倍,粗酶为7.15倍,

3、且粗酶纯化后比活在200U/mg以上,电泳分析证实了纯化效果,显示了很好的工业前景.关键词胰激肽原酶反胶束萃取反萃取CTAB中图分类号Q814.1猪胰脏粗制品材料中主要含有胰蛋白酶,糜蛋白酶,胰淀粉酶,胰脂肪酶,胰激肽原酶,弹性蛋白酶和羧肽酶等.胰酶在临床上主要作为助消化药.而其中的胰激肽原酶(Kallikrein)为周围血管扩张药.有改善微循环作用,用于糖尿病引起的微循环障碍及其他闭塞性周围血管病,具有很高的药用价值….胰激肽原酶为类白色或淡褐色粉末.无臭,易溶于水.等电点为4,8,分子量为30000左右.反胶束萃取技术是近年来发展起来的一种新型分离技术[2,3l.反

4、胶束是溶解在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚集体.在反胶束溶液中,组成反胶束的表面活性剂,它的非极性尾向外伸人非极性有机溶剂主体中,而极性头则向内排列形成一个极性核(p0larcore).此极性核具有溶解水和大分子(如蛋白质)的能力.当含反胶束的有机溶剂和蛋白质水溶液接触时,蛋白质在某种作用力(静电,亲和,疏水)下进入极性核中,然后再调节适当的条件,使蛋白质从负载有机相重新反萃取到水相中,以达到纯化的目的.反胶束萃取的实质是溶剂萃取,因而具有样品处收稿日期:2006.10-23修回日期:2007-01-04?通讯作者,电子信箱:caoxj@oouat.ed

5、u.ca理量大,容易放大和可连续操作的特点,且反胶束内的环境接近细胞内的环境,蛋白质不易变性.反胶束体系特别适用于生物产品的初级分离;与其他方法(如超离心,凝胶过滤层析,亲和技术等)结合使用,还可用于生物产品的纯化.目前胰激肽原酶的制备方法多采用盐析沉淀,凝胶过滤层析,离子交换层析,疏水作用层析,亲和层析等j.这些方法存在操作时间长,不易放大的缺点.本文尝试采用反胶束相转移法萃取和反萃取胰激肽原酶,取得了较好的效果.该分离技术用于胰激肽原酶的分离纯化还未见报道.1材料与方法1.1材料十六烷基三甲基溴化铵CTAB,上海凌峰化学试剂有限公司生产,分析纯;商业用胰激肽原酶,北

6、京东凯元医药生物技术研究院生产,分子量30000,pI4.8,生化试剂;胰酶粗提物,江苏省常熟市蓝天化学生化厂提供;N一苯甲酰一L一精氨酸乙酯BAEE,上海饶纳生物技术有限公司,分析纯;考马斯亮蓝G250,Fluka进口分装,分析纯;丙烯酰胺,分析纯,上海源聚生物科技有限公司;正辛烷,正己醇,甲醇,B-巯基乙醇等试剂均为市售分析纯.94中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1.27No.320071.2方法1.2.1胰酶粗品的制备将冰冻猪胰脏或新鲜胰脏用绞肉机绞碎,加辅料,在一定温度和pH下进行搅拌激活.将激活的胰浆过滤,滤液用乙醇沉淀.将沉淀压榨,脱

7、脂,干燥,磨粉,制粒,得到胰酶粗粉J.1.2.2溶液配置称取CTAB溶解于1:5的正辛烷和正己醇混合液中,配成20mmol/L的无色透明溶液.称取粗酶2.5g溶解于前萃取水相缓冲溶液lOOml,磁力搅拌30min,在4~C,10000r/min离心30min,取上清液.商业酶则直接配成1mg/ml的酶溶液.1.2.3萃取与反萃取室温下,取含胰激肽原酶的水溶液2ml和等体积的反胶束溶液置于具塞试管中,漩涡混合2min直至达到萃取平衡,使胰激肽原酶充分转移至反胶束中,静置分相,测定水相中蛋白质含量及酶的活性,计算萃取收率.取萃取分相后的有机相