cpg-odn和多肽刺激外周血单个核细胞杀伤hepg研究

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1、广东药学院硕士学位论文CpG-ODN和多肽刺激外周血单个核细胞杀伤HepG2研究姓名：戴帆申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：孟民杰20090501广东药学院硕士研究生学位论文中文摘要目的通过将CpG-ODN和多肽单独或联合刺激外周血单个核细胞（PBMC），将活化后的PBMC与HepG2细胞共培养，对HepG2细胞进行杀伤，评价并比较CpG-ODN和多肽的刺激PBMC的杀伤HepG2效应，研究CpG-ODN的免疫激活功能和初步机制；进一步研究CpG-ODN和多肽单独或联合刺激激活PBMC的作用机制，进而探讨CpG-ODN免疫激活功能的作用机制和CpG-OND刺激PB

2、MC杀伤肿瘤的凋亡机制，初步探讨多肽刺激激活PBMC杀伤HepG2的效果和机制。方法将还有CpG寡核苷酸序列的pUC18载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布于氨苄平板37℃培养，挑取阳性若干菌落于37℃小量液体培养，试剂盒抽提质粒，酶切电泳鉴定；将成功转化的大肠杆菌扩大培养，去内毒素质粒大量抽提试剂盒抽提质粒，紫外分光光度法鉴定质粒纯度并计算含量。针对肝肿瘤细胞的特点，设计针对甲胎蛋白的特异性抗原多肽，由公司合成特异性抗原多肽，多肽纯度达到适合细胞试验水平。使用植物凝集素作为刺激PBMC增殖的阳性对照，使用多肽、CpG-ODN、乙肝表面抗原、pUC18质粒作为刺激物作用于PBM

3、C，MTT法检测PBMC增殖效果，使用Excel统计作图。设计合成针对TLR9通道的MyD88、TLR9、Hsp70的PCR引物，以β-actin作为对照，不同浓度CpG-ODN刺激PBMC，提取总RNA并进行反转录后进行多聚酶链反应，琼脂糖凝胶电泳检测MyD88、TLR9、Hsp70的表达情况。使用多肽、CpG-ODN和多肽联合CpG-ODN刺激PBMC后对HepG2进行杀伤，MTT法检测杀伤效果，使用Excel统计作图。提取PBMC杀伤后的HepG2总RNA，反转录并使用Bcl-XL/S、ich3、Bid、Bcl-2为引物做聚合酶链反应，以β-actin作为对照，琼脂糖

4、凝胶电泳检测杀伤后HepG2的凋亡情况。结果CpG-ODN能有效刺激人外周血单个核细胞增殖，刺激PBMC增殖较为稳定，作为佐剂，与多肽联用具有更好的刺激增殖作用，但作为核酸与蛋白质相比，蛋白抗原的刺激增殖能力更强；用不同剂量CpG-ODN刺激PBMC，在1μg/mL浓度时，TLR9通道的mRNAi广东药学院硕士研究生学位论文转录活性较强，0.1μg/mL和10μg/mL浓度mRNA转录活性低于1μg/mL浓度，抗凋亡因子Bcl-2的mRNA同样在1μg/mL浓度有转录，但三个浓度Hsp70都无表达。在48h时间点，经CpG-ODN介导活化的PBMC对HepG2肿瘤细胞的有很

5、强的杀伤活性，其中CpG单用组的杀伤能力最高。在48h的杀伤能力明显高于在72h的杀伤能力。CpG单用组、CpG联合多肽组、多肽单用组、PBMC无刺激物对照组和HepG2组在72h检测时间点上增殖活性均显著高于48h检测时间点上的增殖活性。PCR结果中，多肽和CpG-ODN联用凋亡因子Bcl-XL和Bid都有表达，单用多肽Bid也有表达。结论：CpG-ODN和多肽能有效刺激发生PBMC增殖反应，CpG-ODN刺激PBMC细胞亚群较为广泛，多肽刺激PBMC的细胞亚群具有一定的特异性。CpG-ODN刺激PBMC增殖效果稳定，与蛋白质或者多肽联用刺激PBMC有一定的协同刺激作用。

6、在合适浓度情况下，CpG-ODN刺激PBMC具有抗凋亡作用。CpG-ODN和多肽刺激PBMC后，PBMC杀伤HepG2能力增强，设计合成的多肽能与淋巴细胞肿瘤表位结合，特异性激活T细胞，CpG-ODN联合多肽刺激PBMC杀伤HepG2能力具有一定的协同效应。关键词：CpG-ODN；多肽；细胞免疫；聚合酶链反应；MTTii广东药学院硕士研究生学位论文AbstractObjective:ViaCpG-ODNandpolypeptidesindependentlyoraliiedlystimulateperipheralbloodmononuclearcells,linkedin

7、cebationofperipheralbloodmononuclearcellsactivatedandHepG2,peripheralbloodmononuclearcellskillingHepG2,evaluatePBMCstimulatedbyCpG-ODNsandpolypeptideskillingHepG2,studytheactivatingfunctionofCpG-ODNsandmechanism;investigatethemechanismofCpG-ODNandpolypeptides