水处理微生物学实验讲义(2015)

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1、水处理微生物学实验讲义(2015)（1）你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。（2）在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。2、思考题（1）如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。（2）如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜？并说明理由。实验三、微生物的染色与形态结构的观察一、目的要求1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。2、初步认识细菌的形态特征。3、巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。二、基本原理34简单染色法是利用单一染料对细菌进行染

2、色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。革兰氏染色法氏1884年由丹麦病理学家ChristianGram氏创立的，而后

3、一些革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。然后用乙醇（或丙醇）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。34革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合

4、力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙醇）脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫－碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙醇）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫－碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将

5、介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。三、器材1、菌种实验三中从土壤中分离纯化的各种菌落。2、染色剂（1）吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液）A液：美蓝（methyleneblue）0.6g95%乙醇30mLB液：KOH0.01g蒸馏水100mL34分别配置A液和B液，配好后混合即可。（2）齐氏石炭酸复红染液A液：碱性复红（basicfuchsin）0.3g95％乙醇10mlB液：石炭酸5.0g蒸馏水95ml将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95％乙醇，继续研磨使其溶解，配成A液。将石炭酸溶于水，配成B液。混合A液及B液即成，通常可将此混合液稀释5－10倍使用，稀

6、释液易变质失效，一次不宜多配。（3）革兰氏染色液草酸铵结晶紫染液：A液——结晶紫2g，95％乙醇20ml；B液——草酸铵0.8g，蒸馏水80ml。混合A、B液，静置48h后使用。卢戈氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，全部溶解后，加足水分即可。95％乙醇番红复染液：番红（safranineO）2.5g，95％乙醇100ml。取上述配好的番红乙醇溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。3、仪器或其他用具显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等、34四、操作步骤（一）简单染色1、

7、涂片取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1～2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。2、干燥室温自然干燥3、固定涂面朝上，通过火焰2～3次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为