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《基因座控制区元件hs、hs对β-珠蛋白基因表达调控的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、基因座控制区元件HS2、HS3对β-珠蛋白基因表达调控的研究上海第二医科大学博士学位论文基因座控制区元件HS2、HS3对β-珠蛋白基因表达调控的研究姓名:贾春平申请学位级别:博士专业:生物化学与分子生物学指导教师:曾溢滔2002.5.23上海第二医科大学博士论文基因座控制区元件、对人一珠蛋白基因表达调控的研究中文详细摘要珠蛋白基因的表达具红系组织及发育阶段特异性,这种特性使其成为研究真,是调核基因表达调控的极好材料。位点控制区控珠蛋白基因表达的组织特异性及发育阶段特异性的重要顺式元件之一。:、,是人?活性的重要组成部分,研究、及一对人
2、一珠蛋白基因的时空表达调控,对了解一珠蛋白基因表达的转换机制及一地中海贫血的基因治疗具有重要价值。本工作构建了种、及一元件调控的红系特异表达载体,通过转染培养的红系细胞系和细胞,以及转基因小鼠实验,应用?一表达载体的构建为构建高效的红系特异表达载体,首先,以人基因组为模板,利用?方法克隆出人一珠蛋白基因簇一片段及人的一珠蛋白基因。一长.,包括的、及.的间隔序列。.珠蛋白基因长.,包括.的启动子、个外显子、个内含子及.的’端非编码序列。以.为基本表达载体,采用不同的限制性内切酶及重组技术,构建了种在、、一元件调控下及.珠蛋白基因启动子驱
3、动下以绿色荧光蛋白为报告基因的红系特异表达载体,它们分别是、、、、、、,其中、是在元件调控下的,、是在元件调控下的,而、是在.元件调控下的;、及一载体中,在的’端加上了由珠蛋白基因内含子、外显子及.的’端非编码区组成的片段,、、则不含有此片段。二细胞水平研究为了研究这些载体在细胞水平上的表达情况,我们选择了两种红系细胞系上海医科大学博士论文及细胞,这是两种处于不同发育时期的细胞系。是处于胚胎/胎儿期的人红白血病细胞系,主要表达胚胎及胎儿期的、珠蛋白及部分、一珠蛋白;而是接近成年期的小鼠红白血病细胞系,可表达一珠蛋白。为了观察处于胚胎
4、/胎儿期的细胞中,是否有一珠蛋白基因的转录或表达,以及其转录或表达水平是否受氯化高铁血红素诱导的影响,我们通过及流式细胞仪检测了对细胞中的内源及导入的外源一珠蛋白基因转录及表达水平的影响。结果显示:用./诱导细胞、水平升高,其一珠蛋白水平也及小时后,不仅其一珠蛋明显增加,且这种诱导作用在诱导、小时后比较明显;还可增加重组表达载体在细胞中的瞬时表达。提示诱导红系分化的机理,可能与一珠蛋白基因转换机制相关。为研究、、一及近侧元件在瞬时表达中对/一珠蛋白基因启动子驱动下的表达调控,我们用脂质体介导转染法将~系列表达载体转染到及细胞中,然后用
5、流式细胞仪检测、半定量及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况。结果显示:在.珠蛋白启动子前加上元件后,表达的细胞所占比例由原来的.%增加到%;细胞由.%增加到.%。说明.的元件在及细胞中均可增强.启动子活性。在.珠蛋白启动子前加上元件后,表达的细胞所占比例由.%增加到.%,增加了.%,而表达的细胞所占比例由.%降低到.%,降低了.%,因此,在细胞中并没有增强。珠蛋白启动子的调控功能;而在细胞中可增强.珠蛋白启动子的调控功能,只是增强作用比元件稍差一些。在细胞中,.的功能介于与元件中间,即低于元件,高于元件;而在细胞中,。的功能明显低于、元
6、件,表明、元件在两种细胞中均无明显协同作用。三个体水平的研究为了进一步在个体水平上研究、及一元件对一珠蛋白基因的时空表达调控作用,我们选择/、、、四种重组载体,分别用限制性内切酶、、大量酶切重组载体,经过两上海第二医科大学博士论文步纯化,得到了五种片段:/、/、//、/、/,并用显微注射技术获得了相应的转基因小鼠,平均整合率为.%。为了研究各构建载体在转基因小鼠组织中的表达情况,选择年龄、体重相当的转基因小鼠,用流式细胞仪分析血液、肝脏、骨髓、脾脏、肺、肾脏、心脏、肠、脑等组织中表达情况。结果显示:成年的/及//转基因小鼠中,在各红系
7、组织,如骨髓、脾脏、外周血中均有表达,尤其以骨髓中表达量最高;而在肝脏、肺、肾脏、脑等非红系组织中,没有检测到的表达。表明元件及.的.珠蛋白启动子足以调控一珠蛋白基因的组织特异性表达。为研究不同重组载体的表达情况,经流式细胞仪分析及荧光显微镜下观察各相应的转基因小鼠外周血中表达情况,结果如下:两只/小鼠中,表达的阳性细胞数平均为.%.%、.%;只/小鼠中,表达的阳性细胞数平均为.%%、.%、.%、%、.%、.%;%、.%、只//小鼠中,表达的阳性细胞数平均为.%.%、.%、.%、.%、%、.%:只/小鼠中,表达的阳性细胞数平均为.%%
8、、.%、.%、.%;只/小鼠中,表达的阳性细胞数平均为.%.%、%、%。表?结果表明:在转基因小鼠中,的表达虽有明显的个体差异,但综合分析比较可以看出,与元件在调控一珠蛋白基因表达方面,其增强子作用基本相当,且二者显示出
