影响急性冠脉综合征患者基质金属蛋白酶-相关因素的研究

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1、独创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库

2、进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文前言急性冠脉综合征(acutecoronarysyndrome，ACS)是导致冠心病患者住院和死亡的主要原因。它主要是由不稳定的冠状动脉粥样硬化斑块出现裂缝、溃疡或破裂并触发血栓形成所致[1]。近年研究认为基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinasesMMPs)可使冠状动脉粥样斑快的纤维帽变

3、薄，引起破裂和溃疡形成，是造成斑块不稳定的重要原因之一[2]。目前研究表明动脉粥样硬化是一种免疫炎症疾病，炎症因素在动脉粥样硬化的发生和发展中发挥重要作用，天然免疫和获得免疫均参与动脉粥样硬化的炎症过程[3]。动脉粥样硬化斑块内聚集着大量的单核巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等炎症细胞。这些细胞活化后通过一系列的炎症免疫反应释放基质金属蛋白酶和炎性因子，溶解细胞外基质，使纤维帽变薄易于破裂。白细胞分化抗原40及其配体(CD40-CD40L)系统是炎症免疫反应的枢纽，参与动脉粥样硬化发生、发展乃至斑块破裂的全过程。在CD40-CD40L下游信号通路中，NF-κB

4、是一种具有基因转录多向调控作用的转录因子，它的激活及导致的炎症因子基因的表达在动脉粥样硬化发生、发展中起重要作用[4]。本研究旨在观察急性冠脉综合征患者血清sCD40L的水平和外周血单个核细胞NF-κB的活性及它们与MMP-9的相关性，探索急性冠脉综合征的预测和治疗的新思路。3华中科技大学硕士学位论文材料与方法1.试剂(1)人MMP-9ELISIA试剂盒购自美国R&D公司(2)人CD40LELISIA试剂盒购自美国R&D公司(3)鼠抗人核因子κBp65单克隆抗体购自美国SantaCluz公司(4)鼠抗人核因子κBp50单克隆抗体购自美国SantaCluz公司

5、(5)辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠IgG单克隆抗体购自美国SantaCluz公司(6)亲和素标记的酶标板购自深圳晶美生物工程有限公司(7)淋巴细胞分离液购自中国医学科学院2.溶液配制1)PBS溶液将药品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4・H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。2)细胞裂解缓冲液Lysisbuffer3.5mol/LNaCl100mmol/LMgCl2100mmol/LEDTANP-40Glycerol1m

6、ol/LHEPESddH2O临用前加入DTT、cocktail3)结合缓冲液Bindingbuffer1mol/LHEPES1mol/LKCl2ml0.2ml0.1ml0.2ml4ml0.4ml12.9ml40µl1ml4华中科技大学硕士学位论文10mg/mlsalmolspermDNAGlycerolddH2O临用前加入0.1mol/LDTT2%BSA20µl800µl6.64ml500µl1ml4)ELISA洗涤缓冲液（pH7.4PBS）KH2PO4Na2HPO4.12H2ONaClKClTween-20加ddH2O定容至1000ml0.2g1.

7、56g8.0g0.2g1ml5)BSAELISA抗体稀释液0.1g洗涤缓冲液100ml6)0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4.12H2OddH2O7.31g100ml7)0.1mol/L柠檬酸柠檬酸ddH2O1.92g100ml8)ELISA底物缓冲液0.2mol/LNa2HPO40.1mol/L柠檬酸ddH2O25.7ml24.3ml50ml9)TMB储存液5华中科技大学硕士学位论文TMB无水乙醇20mg10ml10)ELISA显色液TMB储存液底物缓冲液30%H2O20.5ml10ml25µl11)ELISA终止液178

8、.3mlddH2O逐滴加入21.7ml的98%浓硫酸