建立fqpcr定量体系检测新型隐球菌cap10 mrna

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1、建立FQPCR定量体系检测新型隐球菌CAP10mRNA作者：戴琳孙，林旎，陈勇，江凌　程祖建，欧启水【摘要】目的建立荧光定量PCR（FQPCR）技术定量检测新型隐球菌（CN）的荚膜相关蛋白10（CAP10）基因mRNA，为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。方法用逆转录PCR的方法从CN标准株（ATCC34874）中扩增得到CAP10，构建重组质粒标准品pGEMTEasyCAP10，以倍比稀释的标准品制备标准曲线。设计引物和探针，建立FQPCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。结

2、果成功构建了重组质粒标准品pGEMTEasyCAP10，并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3.11X+38.84。批内重复性试验CV值为0.31%，批间重复性试验CV值为2.73%。FQPCR体系能特异扩增新型隐球菌，特异性好，该体系的线性范围为101copies/μL～108copies/μL。结论成功建立CN的CAP10mRNA的定量检测方法；该方法重复性好，特异性强。【关键词】细胞荚膜；隐球菌，新型；真菌蛋白质类；逆转录聚合酶链反应；mRNA，信使新型隐球菌（cryptococcusneof

3、ormans，CN）的荚膜相关蛋白10（capsuleassociatedprotein910，CAP10）对荚膜的形成是必不可少的，它在毒力的形成和维持中起至关重要作用[12]。传统的实验诊断项目，如脑脊液（cerebrospinalfluid，CSF）隐球菌计数、抗原测定和培养等手段灵敏度低、耗时长，无法准确评估CN的毒力和活力[3]。本研究拟建立实时荧光定量PCR（realtimefluorescentquantitativePCR，FQPCR）技术检测CN的CAP10基因mRNA，既可为CN的诊

4、断，尤其是毒力和活力的判断提供敏感、特异的定量手段，又可为治疗CN的效果和预后判断提供依据。1材料与方法1.1材料CN标准菌株（ATCC34874）购自上海第二军医大学附属长征医院皮肤病学研究所；结核杆菌由福州市肺科医院提供，脑膜炎双球菌和金黄色葡萄球菌由本室分离保存；RNA提取Trizol试剂自（美国invitrogen公司）；ReverseTranscriptionSystem、TaqDNA聚合酶、缓冲液、dNTP及pGEMTEasyVecto购自（美国Promega公司）；DNA纯化回收试剂盒、普通质

5、粒小提试剂盒和真菌裂解液及溶壁酶自（北京天根生化科技公司）。1.2RNA的提取及逆转录反应取CN标准株及CSF标本离心沉淀物，加入溶壁酶20μL混匀后37℃水浴30min破壁，离心弃上清，按TrizolRNA提取试剂盒说明书操作抽提RNA。取上述总RNA按试剂盒说明进行逆转录反应，被逆转录的为CN的mRNA。91.3引物与探针的设计与合成比对CN5种血清型（A、B、C、D、AD）CAP10基因，寻找同源序列，用Primer5设计CAP10特异性引物和探针（5’→3’）：上游：CCAAGCCCCCAAACCTC

6、CCATACA下游：AACGCGTACCATTCATCAAAGCCCTaqMan探针：CCTCTTCTTGTACTCAGCAACGGCTTCGGGCAA探针5'端由FAM标记，3'端由TRAMA标记。引物及探针均由美国invitrogen公司合成并纯化，目的片段大小为175bp。1.4标准品的制备（1）目的DNA片段的制备：PCR反应体系含Mg2＋（25mmol/L）3μL，10×buffer2.5μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，上下游引物（25μmol/L）各0.25μL，Taq聚合酶（5U

7、/L）0.3μL，DNA模板3μL，加灭菌纯水至总体积为25μL。反应条件为94℃5min，94℃45s→56℃45s→72℃45s，35循环，72℃延伸7min。1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压60～80V，电流强度20～309mA)，检测PCR产物。（2）载体的构建、鉴定和拷贝数的换算：采用胶回收试剂盒纯化回收切下的琼脂糖凝胶上的目的片段，目的片段与质粒pGEMT连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中,37℃过夜培养，筛选出重组体，提取质粒，扩增，根据电泳结果，重新将重组体培养至LB培养基，37℃摇床过夜，

8、纯化质粒，送上海生工公司测序，测吸光度(D)值,根据阿佛加德罗常数(6.023×1023分子数/摩尔)换算为分子拷贝数。1.5FQPCR反应体系的建立（1）标准曲线的制备：利用ABI7000SequenceDetector仪器在最优化的反应体系及反应条件下，将插有目的DNA的质粒10倍倍比稀释成107，106，105，104，103拷贝数/微升，用作定量标准品制备标准曲线，以此定量未知模板的浓度。