受体介导基因转移的策略研究与进展

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1、受体介导基因转移的策略研究与进展　摘要基因转移是基因治疗中一个关键的环节。受体介导的基因转移具有靶向、有效和安全、无毒的特点，且操作简便，因此有望成为一种理想的体内基因转移技术用于基因治疗。　　关键词受体介导；基因转移　　受体介导的基因转移是将目的基因与配体连接，通过配体与细胞表面的特异性受体结合，以受体介导的内吞作用将目的基因转入细胞。配体与受体的特异性结合以及受体介导的内吞作用是一种生理过程，因此受体介导的基因转移有靶向、有效和安全、无毒的特点，这使它和其它基因转移技术相比具有独特的优势，尤其是用于体内基因转移。　　1方法和原理10　　配体与目的基因的连接，一般是通

2、过多聚赖氨酸等多聚阳离子。配体与这些多聚阳离子的连接，是通过加入化学物质，形成共价的化学结合，然后与含目的基因的质粒以适当的比例在室温下混合。带负电荷的质粒DNA与多聚阳离子形成牢固、稳定的非共价电性结合。这种结合方式决定了DNA的表达不受影响。结合后的DNA缩合成致密的杆状或球状，外周覆盖着多聚阳离子和配体，此配体-多聚阳离子-DNA复合物呈可溶性，直径约100nm[1]，通过受体介导的内吞作用进入细胞后形成囊泡状的核内体。最终部分核内体与溶酶体融合，DNA被溶酶体酶降解，部分核内体膜破裂后DNA进入细胞质，再进入细胞核内进行基因表达。也有将配体嵌入包裹目的基因的磷脂

3、双层中[2]，或将目的基因与含配体的融合蛋白连接[3]进行受体介导的靶向性基因转移。　　2受体介导的基因转移类型　　2.1脱唾液酸糖蛋白受体介导的基因转移10　　脱唾液酸糖蛋白受体是肝细胞表面独有的受体。Wu等以此受体介导，将HBV病毒的反义DNA转入体外培养已感染HBV病毒的人肝癌HepG2细胞，可使HBV病毒复制明显受到抑制，24h后HBV表面抗原及HBV的DNA均较无配体对照组下降约80%，而且6d内无明显上升[4]。用于体内，Wu等给小鼠静脉注射细菌的氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）与脱唾液酸糖蛋白复合物，10min后处死动物，发现32P标记的DNA85%分布在

4、肝脏，5%在血中，并在肝组织检测到酶活性。而单独注射CAT的对照组仅17%在肝脏，46%停留在血中，肝组织未检互酶活性[5]。以此受体介导将低密度脂蛋白受体基因转入缺乏此基因的免疫体内，使高脂血症得到部分纠正[6]。说明脱唾液酸糖蛋白受体介导的体内基因转移具有很高的靶向性和有效性，提示多种与肝脏酶缺陷有关的遗传性疾病有望通过此受体介导达到基因治疗的目的。　　2.2甘露糖受体介导的基因转移　　甘露糖受体存在于巨噬细胞表面，此受体介导，将肿瘤坏死因子（TNF-α）反义RNA转入体外与二氧化硅共孵育的巨噬细胞，可阻止巨噬细胞在二氧化硅诱导下分泌TNF多的作用，TNF分泌量仅为

5、无配体对照组的1/5[7]。给小鼠静脉注射含荧光素酶基因的质粒与甘露糖化多聚赖氨酸复合物，在脾、肝、肺均检测到酶活性。其中以脾脏组织酶活性最高[8]，这和巨噬细胞最富集于脾脏相一致，说明甘露糖受体在体内基因转移中也具有器官靶向性。10　　2.3胰岛素受体介导的基因转移　　胰岛素受体存在于多种组织细胞表面，因此在体内基因转移中往往缺乏专一的器官靶向性。Sobolver等成功地进行了胰岛素受体介导的小鼠和羊乳腺上皮细胞体外基因转移后。采用局部途径给药的方法，经小鼠和羊乳腺导管注射荧光素酶基因与胰岛素复合物，在乳腺组织中检测到酶活性，将人β-乳清蛋白基因与荧光素酶基因连接后以

6、同样方法体内应用，在乳液中也检测到酶活性[9]，说明受体介导的体内基因转移不但能够合成细胞内蛋白，而且还能合成分泌型蛋白。　　其他学者还进行了转铁蛋白受体[10]、成纤维生长因子受体[11]、叶酸受体[2]、c-kit[12]受体以及单克隆抗体为配体[1]的受体介导的体外基因转移。　　3提高体外基因转染效率的策略　　受体介导的基因转移中，不同细胞、不同受体转移率亦不同。与细胞表面10受体密度、配体与受体的亲和力等因素有关。由于在部分外源基因进入细胞后容易被溶酶体酶降解，因此一般来说受体介导的基因转移效率较低，但是通过采取措施可获得较理想的效果：加入双岐性分子氯奎，利用氯

7、奎的弱碱性阻止核内体的酸化，进而阻止其与溶酶体融合。DNA被溶酶体酶降解几率减少，进入核内的量增加，使基因表达增强。在受体介导的体外基因转移中，加入100μmol/L氯奎，能使转染率由0.1%提高到1%[1]。　　加入膜不稳定剂，促进核内体膜破裂使目的基因进入细胞质，进而进入核内进行基因表达：①加入复制缺陷腺病毒或将复制缺陷腺病毒与目的的基因配体复合物连接，利用腺病毒衣壳蛋白的膜不稳定作用，可使基因转染率提高至近100%。所加病毒数量相同时，将复制缺陷腺病毒连接于目的基因配体复合物效率更高[13]。用脂补骨素或紫外线照射灭活腺病毒核酸，但