实时荧光定量pcr检测限的统计推断

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1、实时荧光定量PCR检测限的统计推断　　　　　　　作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武【摘要】检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQPCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果≥4时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996，而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0

2、的概率为0。结果在905拷贝/ml～1095拷贝/ml的概率为0.997；而100000拷贝/L表示一次抽样结果在997000拷贝/L～1003000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。【关键词】实时荧光定量PCR；检测限；统计推断　　StatisticalConclusionofLimitofQuqntitationinRealtimeFluorescenceQuantitativePCR9　　Abstract:Limitofquantiationisaimportantperformanceindexofassaymethods.Resultsofsampl

3、edrawingarecalculatedthroughpossiblityfunctionequationofPoissondistribution,thenthepossibilityofresultsemergedinpopulationisdeduced.Forexample,inRealtimeFluorescencequantitaivePCRtoassayHBVDNA,onlywhensampledrawingresults≥4,significanceofdifference(P<0.05)couldbededucedbetweenpopulationandblank.

4、Solimitofquantitationis4copies/uldenoting0inonesampledrawingis0,andPossibilityofresultsbetween905copies/mlto1095copies/mlis0.997.Possibilityof100000copies/Ldenotingresultsbetween997000copies/Lto1003000copies/Linonesampledrawingis0.997.SampledrawingunitulcouldnotbereplacebymlorL.　　Keywords：RealtimeF

5、luorescencequantitativePCR；Limitofquantitation;Statisticalconclusion9　　检测限是检测方法的重要性能指标，只有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限，该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。能检测到的最低分析物浓度为检测系统的检测限。当前，检测限术语混乱，如：灵敏度(sensitivity)、分析灵敏度(analllyticalsensitivity)、定量限度(limitofquantitqtion)等［1］。每个词语的实际含义中包含有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等。我们采用统计学方法，

6、以期得到一致的实时荧光定量PCR(Realtimefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,FQPCR)检测限，现介绍如下。　　1文献中FQPCR检测限的描述　　检测乙型肝炎病毒DNA的文献中检测限使用了“最低检出量”［2，3］、灵敏度［5～7］等术语，它等于已知的高拷贝HBVDNA血清10倍系列稀释后能检测到扩增曲线的最大稀释倍数管浓度。表述有：阴性HBVDNA≤106拷贝/升［4］；荧光定量PCR法检测灵敏度102拷贝/ml［5］、104拷贝/ml［6］、8.6×102拷贝/ml［7］；HCⅡ法检测灵敏度1.4×105拷贝/ml

7、［7］；103Eq/ml理论值时到达检测极限［3］；PCRFP检测HBVDNA的最低检测出量1×101拷贝［2］；bDNA在105Eq/ml时到达检测极限［3］。以上检测限术语各不相同，且同一方法检测HBVDNA在上述各实验室发出同样的“HBVDNA低于检测下限”的报告时其实际HBVDNA拷贝数相差可达100倍。　　2FQPCR检测过程简介9　　以测定血清乙型肝炎病毒DNA为例：将40μl血清