反相高效液相色谱法测定蜂胶水提物中的酚类化合物

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1、反相高效液相色谱法测定蜂胶水提物中的酚类化合物作者：陈滨罗丽萍丽艳徐元君付宇新高荫榆【摘要】建立了同时测定中国蜂胶水提物中23种酚类化合物的反相高效液相色谱（RPHPLC）分析方法。采用ZORBAXEclipseXDBC18色谱柱（150mm×4.6mm×5μm）；流动相：甲醇0.1%甲酸，梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长为256和280nm，进样量20μL，柱温35℃。各对照品质量浓度与色谱峰面积线性关系良好，具有较好的精确度和重现性，标准加入回收率在93.29%～106.61%之间。采用此法，从河北蜂胶中检测出

2、18种对照品，其中表儿茶素含量最高35.50mg/gWEP，其次是3,4二甲氨肉桂酸15.41mg/gWEP。而云南蜂胶中检测到9种对照品，表儿茶素含量最高11.23mg/gWEP，其次是白杨素3.61mg/gWEP，两地蜂胶WEP的HPLC图相似度分别为0.099(256nm)和0.194(280nm)，化学成分差异明显。【关键词】反相高效液相色谱法，蜂胶，水提物，酚类化合物　　1引言13　　蜂胶（Propolis）是蜜蜂采集杨树等植物的新芽和受伤部位的渗出液，在口腔中加工转化而成的一种胶状物质。在低温时会变硬变脆，温度升高

3、时会变软，并具有一定的粘性。蜂胶中含有300多种化学成分，其中包括芳香族和黄酮类、有机酸、萜烯类物质、维生素、酶类等[1]。蜂胶具有抗氧化、抗菌、消炎、抗病毒、保肝和抗癌等作用[2]。　　由于蜂胶的多数有效成分容易被醇提取，所以关于蜂胶醇提物的研究报道很多[3,4]，而蜂胶水提物（Waterextractionofpropolis,WEP）的报道较少，且多集于巴西蜂胶。巴西绿蜂胶（Greenpropolis）适宜用水提取[5]。WEP中含有大量的酚酸类化合物。Mishima等[6]采用HPLC从巴西WEP中检测出异樱花素、燕茜素

4、、绿原酸、对香豆酸、阿替匹林、咖啡酰奎宁酸等物质。Matsui等[7]研究表明，巴西WEP比醇提物有更好的抗氧化作用，可以更好地抑制一些酶的活性[7]。Banskota等[8]发现巴西和中国WEP比醇提物具有更强的DPPH自由基清除能力，反之，秘鲁蜂胶和荷兰蜂胶是醇提物强于WEP。WEP对化学和免疫学肝损伤模型都有保肝作用，并具有抗血小板凝结、抗炎、保护视神经、免疫调节、抗肿瘤和抗菌等活性[9～11]。WEP还可以避免醇提液产生的副作用[12]，具有很好的应用前景。但目前尚未见关于中国WEP化学组成的研究报道。13　　HPLC是

5、分析WEP化学成分的主要方法。Mishima[6]和Orsolic[13]等分别对巴西等国蜂胶建立了HPLC方法，并测定了其WEP成分，但所用对照品较少。本研究选用了23种酚类化合物为对照品，通过对RPHPLC法的优化，建立了适合分离中国蜂胶WEP的方法，并考察了其重现性、检出限和加标回收率等参数。用本法测定了的两种中国蜂胶WEP的化学组成。本研究为全面了解中国蜂胶化学成分多样性提供了依据。　　2实验部分　　2.1仪器与试剂　　美国Agilent1200型高效液相色谱仪，包括在线脱气装置，四元泵，柱温箱，光电二极管阵列检测器(

6、DAD)，G2170BALC化学工作站。　　肉桂酸、槲皮素、柚皮素、染料木素、山奈酚、芹菜素、p香豆酸、阿魏酸购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心（江西）；没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、木犀草素、异鼠李素、桑黄素、黄芩素、α儿茶素、芦丁购自中国药品生物制品检定所（北京）；杨梅酮、菲瑟酮、生松素、3，4二甲氧基肉桂酸、白杨素购自SigmaAldrich公司；芦丁、杨梅酮、生松素（纯度≥95%），菲瑟酮、3，4二甲氧基肉桂酸、白杨素（纯度≥99%）；其余对照品纯度≥98%。甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水为超纯水。

7、13　　2.2标准溶液的配制　　分别称取各对照品5.0mg于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，终浓度为1.0g/L，过0.45μm滤膜后置于4℃冰箱中避光保存，作为储备液。其它对照品由储备液稀释得到。　　2.3样品溶液的配制　　原胶分别采自河北石家庄和云南西双版纳，简写为HB和YN。置于－18℃冷冻变硬变脆后，用木锤敲打砸成小碎块，用药材粉碎机粉碎后，于－18℃保存备用。　　对文献[14]的蜂胶水提取方法进行了改进。具体方法是：取4.0g蜂胶，在120mL蒸馏水中混匀，在60℃下水浴提取7h。提取液离心30min，收集上清液。残

8、渣在同样条件下再提取1次。合并提取液，于60℃真空旋转蒸发仪浓缩，得到固态WEP；用蒸馏水复溶，配制成10g/LWEP溶液，经0.45μm滤膜过滤后，置于4℃冰箱中保存，待测。　　2.4色谱条件　　ZORBAXEclipseXDBC18色谱柱（150mm×4.6