klotho蛋白对帕金森病模型小鼠的神经保护作用

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1、Klotho蛋白对帕金森病模型小鼠的神经保护作用【摘要】目的观察Klotho蛋白对1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)诱导所致C57BL/6小鼠黑质神经元损伤的保护作用，并探讨其可能的保护机制。方法C57BL/6小鼠分4组：野生型(WT)生理盐水(NS)对照(WT+NS)组，野生型MPTP(WT+MPTP)组，Klotho蛋白高表达型(KO)生理盐水对照组(KO+NS)，Klotho蛋白高表达型MPTP组(KO+MPTP)。WT+MPTP组和KO+MPTP组小鼠皮下注射MPTP(20mg/kg)，连用2d制备帕金森病(PD)模型;WT+

2、NS和KO+NS皮下注射等体积生理盐水。用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学法观察黑质神经元的变化;应用高效液相电化学方法(HPLC)检测纹状体(Str)多巴胺(DA)及其代谢产物3，4二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量变化。结果KO+MPTP组黑质致密带(SNc)TH免疫阳性神经元数目较KO+NS组有所减少，但差异不显著;而WT+MPTP组SNc区TH免疫阳性神经元数目较WT+NS组明显减少(P<0.01)。KO+MPTP组小鼠Str区DA及其代谢产物DOPAC含量较KO+NS减少，但差异不显著，HVA含量的改变差异显著(P<

3、;0.05);而WT+MPTP组DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量较WT+NS明显减少(P<0.01)。结论Klotho蛋白可以拮抗MPTP对小鼠黑质多巴胺能神经元损伤，其机制可能因为Klotho蛋白是成纤维细胞生长因子23(FGF23)信号转导中其受体的基本辅助因子及抗氧化应激作用有关。11【关键词】Klotho蛋白;帕金森病;多巴胺能神经元;黑质帕金森病(PD)又称震颤麻痹，是一种多发于65岁以上人群、男性略多于女性的中枢神经系统退行性疾病，其最主要病理特征为中脑黑质致密带(SNc)多巴胺(DA)能神经元进行性变性、脱失及伴发的纹状体轴突末梢

4、DA耗竭，最终造成PD特有的运动功能障碍，其典型症状为静止震颤、肌肉僵硬、运动迟缓及姿势反射异常〔1〕。长期以来，左旋多巴是治疗PD的首选药物〔2〕，但仅能对症处理，且长期应用有明显的不良反应，多数患者服药3～5年后疗效减退，产生症状波动、运动障碍、精神症状等不良反应，使治疗更加困难。因此，研究者一直在试图寻找有效的神经保护剂预防DA能神经元变性，从而延缓PD的发生。Klotho蛋白与人类衰老密切相关〔3〕。该蛋白缺陷鼠可出现一系列与人类衰老相似的多种行为和病理变化：寿命缩短、运动失调、性功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、骨质疏松、肺气肿和免疫功能降低

5、等;基因敲除小鼠的步态异常，平均步长明显缩短，类似人类PD患者的步态;使用一定的方法使小鼠重新获得基因，上述各种症状均能缓解〔4〕。1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)具有特异性的神经毒性作用，能导致人类及多种动物出现PD症状〔5〕。本研究以对MPTP最敏感的C57BL/6小鼠为研究对象，用MPTP制备小鼠PD动物模型，观察Klotho蛋白对MPTP导致的黑质DA能神经元损伤的影响，并对其机制进行了初步探讨。11　　1材料与方法　　1.1主要试剂与仪器酪氨酸羟化酶(TH)抗体购自美国ProtosBiotech公司;MPTP购自美国Sig

6、ma公司;TH免疫组化试剂盒、DAB试剂购自美国VectorLaboratories公司;高效液相色谱仪为美国Waters公司产品。　　1.2动物分组及处理24只8～10周龄C57BL/6雄性小鼠由美国德州大学西南医学中心制备并提供，体质量(21±2)g，于18～20℃室温及相对湿度50%～60%昼夜循环光照条件下生活，自由饮水、取食，人工昼夜节律(12～12h)。动物分为4组：野生型(wildtype)生理盐水对照(WT+NS)组，野生型MPTP(WT+MPTP)组;Klotho蛋白高表达型(Klothooverexpressing)生理盐水对照(KO

7、+NS)组;Klotho蛋白高表达型MPTP(KO+MPTP)组。WT+MPTP组和KO+MPTP组小鼠于每天16:00给予皮下注射MPTP(20mg/kg)，连用2d;WT+NS和KO+NS组小鼠皮下注射等体积生理盐水。给药后立即观察MPTP的急性毒性反应，观察6d内小鼠的行为学改变，包括反应、自发活动、肌肉运动、运动障碍、异常行为等。　　1.3TH免疫组织化学染色　　1.3.1取材及冰冻切片于末次注射711d后将小鼠安乐死，然后断头取脑组织，置于含50mg/ml多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲固定液(PBS)中4℃固定6h，再置入含250g/L蔗糖的

8、PBS溶液内4℃过夜或至脑组织块沉入瓶底。将脑组织块于冠状黑质平面