il12调节蛋白酶激活受体在肥大细胞的表达

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1、IL12调节蛋白酶激活受体在肥大细胞的表达作者：张慧云林青,林丽艳,张忠芳,杨海伟何韶衡【摘要】目的:探讨IL12对肥大细胞蛋白酶激活受体（PARs）表达的影响。方法:不同浓度IL12刺激肥大细胞后,在不同时间点,用实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRTPCR）和流式细胞术（FCM）,在mRNA水平和蛋白水平检测PAR1、PAR2、PAR3和PAR4在肥大细胞P815表面和胞内的表达情况。结果:IL12下调肥大细胞膜表面PAR2蛋白的表达,上调肥大细胞膜表面和胞质内PAR4蛋白的表达,IL12抗体的应用可阻

2、断IL12对肥大细胞PARs蛋白表达的影响;IL12上调肥大细胞PAR1、3、4mRNA的表达,下调PAR2mRNA的表达。结论:IL12在过敏性炎症反应中的调节作用可能与IL12调节肥大细胞PARs表达有关。【关键词】蛋白酶激活受体;肥大细胞;实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRTPCR）;流式细胞术（FCM）蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors或proteinaseactivatedreceptors,PARs）是G蛋白偶联受体（Gproteincoupledreceptor,G

3、PCR）家族中的新成员,目前在人和小鼠体内共发现了4种PARs,即PAR1、PAR2、PAR3和PAR4,12它们的基因序列于1991、1994、1997和1998年被先后克隆出来［1］。有关的研究显示PARs是哮喘、肺水肿和气道高反应性疾病病理生理过程中的重要效应受体,一些病理情况伴随着PARs表达的改变:过敏性鼻炎患者鼻黏膜PAR2表达增强,哮喘患者气道PAR2表达增强,小鼠气道病毒感染时PAR1和PAR2表达上调。尽管有研究显示扁桃体、皮肤、和结肠来源的肥大细胞表达PAR2,然而仍缺乏PAR对肥大细胞功能影

4、响方面的研究。抑制Th2细胞克隆、调节Th1细胞分化,调节先天免疫反应、决定后天免疫反应的类型和持续时间的IL12亦与过敏反应的发生有关［2,3］。因此我们首先探讨炎症性细胞因子IL12对肥大细胞PAR表达的调节作用为进一步探讨PAR表达对肥大细胞功能影响的研究奠定基础。1材料和方法1.1材料小鼠肥大细胞株P815（美国标准培养物保藏中心,ATCC）。青链霉素、PBS（10×）、牛血清白蛋白（BSA,V级）和多聚甲醛均购自Sigma公司,DMEM、胎牛血清和TSTIM购自HyClone公司,TRIzolReagent购自In

5、vitrogen公司,ExScriptTMRT试剂盒、SYBRPremixExTaqTM(perfectrealtime)和PCRMarker购自TaKaRa公司,IL12和抗IL12单克隆抗体（mAb）购自R&D公司,FITC标记的羊抗鼠PAR2mAb、兔抗鼠PAR1mAb、兔抗鼠PAR3多克隆抗体、兔抗鼠PAR4多克隆抗体购自SantaCruz公司,12FITC标记的羊抗兔多克隆抗体购自BDPharmingen公司,琼脂粉购自BBI公司,SYBRGreenI核酸凝胶染料购自BMA公司。细胞培养箱购自德

6、国Heraeus,生物安全柜HFsafe1200购自HealForce公司,台式高速冷冻离心机centrifuge54158、58108购自eppendorf公司,紫外分光光度计SmartSpec3000和电泳仪购自BIORAD公司,PCR扩增仪PTC200购自MJResearch公司,凝胶成像分析系统购自SYNGENE公司,FACSCalibur流式细胞仪购自BectonDickinson公司,ABIPRISM7700型荧光定量PCR扩增仪购自ABIPE公司。1.2方法1.2.1肥大细胞培养与激发P815细胞接种于75cm

7、2培养瓶(Falcon)内,用ATCC完全培养液（DMEM内含4mmol/L的L谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、100mg/LFBS、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素）于37℃、50mL/LCO2培养箱中培养。以上细胞经无血清培养6h后用不同浓度的IL12（0.1～100μg/L）及IL12阻断抗体（10、30mg/L）处理细胞,分别于2h、6h或16h终止反应,4℃条件下450g离心10min后收集细胞重悬用于流式细胞术(FCM)分析和实时定量PCR分析。1.2.2FCM分析上述激发后细胞经2

8、0g/L多聚甲醛固定30min后PBS洗涤后重旋。PAR1,PAR3和PAR4的标记:加兔抗鼠PAR121mAb或兔抗鼠PAR3、PAR4多克隆抗体以及同型对照2mg/L,37℃孵育1h。用含10g/LBSA的PBS洗涤2次后加FITC