四种嵌合免疫受体在t淋巴细胞中的表达分析

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1、四种嵌合免疫受体在T淋巴细胞中的表达分析作者：骆耐香陈森洲徐雅娟【摘要】　　目的利用基因工程技术构建含人源抗癌胚抗原(CEA)单链抗体(scFv)的4种嵌合免疫受体（CIR），比较其在T淋巴细胞表面表达的情况。方法将构建好的嵌合免疫受体CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3通过电穿孔方法分别转染人T淋巴细胞，流式细胞仪检测各嵌合免疫受体在T淋巴细胞的表达情况。结果有3种嵌合免疫受体成功表达在T细胞的表面，它们分别是CIR1、CIR2、CIR3，其中CIR3的表达更好。结论嵌合免疫受体能够在T淋巴细胞的表面有效表达，为下一步的体内实验打下基础，同时为这

2、一治疗策略最终应用于临床提供可靠的实验依据。【关键词】嵌合免疫受体；癌胚抗原；电穿孔转染；流式细胞术；人T淋巴细胞【Abstract】ObjectiveTocomparetheexpressionsoffourchimericimmunereceptors(CIRs)withanticarcinoembryonicantigen(CEA)scFvgeneonhumanTlymphocyteviaelectroporationinvitro.MethodsFourCIRs(CIRZ,CIR1,CIR2,CIR3)withantiCEAscFvg

3、eneweretransfectedintohuman8peripheralbloodmononuclearcells(PBMCs)obtainedfromhealthyadultsrespectively.TheexpressionsofsurfacemoleculesofCIRsweredetectedbyflowcytometryafter16hourtransfection.ResultsFlowcytometryshowedthatCIR1,CIR2,CIR3geneswereefficientlyexpressedaftertransf

4、ection.ButCIRZcannotbedetectedanyexpression.ConclusionsThreekindsofCIRgenescansuccessfullyexpressonhumanTlymphocytessurface.Itcanbethefoundationofthefurtherstudyandcanprovidethereliableevidenceforclinicalusingthistherapy.【Keywords】Chimericimmunereceptor;Carcinoembryonicantigen;

5、Electroporation;Flowcytometry;HumanTlymphocyte8　　大多数肿瘤相关抗原(TAA)是自身抗原，由于胸腺的选择机制和耐受机制，机体针对这些抗原产生的T淋巴细胞中大多数T细胞受体（TCR）的亲和力都比较低，从而限制了其肿瘤识别及杀伤效果。将克隆的高亲和力识别TAA的T淋巴细胞受体也称嵌合免疫受体（CIR）通过基因转染技术转染给T淋巴细胞，可以使重定向的原来无肿瘤识别能力的T细胞在体外和体内有效识别并杀伤肿瘤细胞〔1〕。近年来利用基因工程技术构建的T淋巴细胞嵌合免疫受体，它包括识别TAA的单链抗体（scFv）和T

6、淋巴细胞的活化基序，通过真核细胞表达载体转染T淋巴细胞，使T淋巴细胞能识别并杀伤肿瘤细胞。我们将含人源化抗癌胚抗原(CEA)scFv的4种CIR，即CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3，转染人T淋巴细胞后检测其在人T淋巴细胞的表达，筛选出高表达的CIR，为进一步进行体内实验提供基础，同时为这一治疗策略最终应用于临床提供可靠的实验依据。　　1材料与方法　　1.1主要仪器和材料　　电穿孔仪NucleofectorTM为AmaxaBiosystems公司产品，流式细胞仪FACSCalibur为美国BDBiosciences公司产品。培养基AIMV购自S

7、igma公司。健康人外周血由福冈红十字血液中心提供。CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3为本研究室制备，见图1。别藻兰蛋白(APC)标记试剂盒购自日本Dojindo分子技术有限公司，按说明将其标记CEA。　　1.2细胞分离与培养　　按常规方法分离淋巴细胞。将分离的人T淋巴细胞在含10%小牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的AIMV培养基中，37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养，每2天换液1次，取对数生长期细胞备用。8　　1.3基因转染　　将4种CIR通过电穿孔的方式转染人T淋巴细胞。按照产品说明，用100μl电穿孔液Nucleo

8、fectorSolution重悬T细胞2×106后，加入4μgCIR，使用程序A23进行电穿孔转染后即移