单核细胞源性泡沫细胞trem1的表达

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1、单核细胞源性泡沫细胞TREM1的表达【摘要】　　目的探讨髓系细胞触发受体1(TREM1)在氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxLDL)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞中的表达情况。方法先后用PMA、oxLDL诱导人U937细胞，使其转化为泡沫细胞。用RTPCR法及Western印迹法检测PMA诱导组、低密度脂蛋白（LDL）组和oxLDL组细胞中TREM1mRNA及蛋白的表达。结果与PMA诱导组、PMA+LDL组细胞比较，PMA+oxLDL组细胞TREM1mRNA及蛋白表达水平均明显增高（P&

2、lt;0.05）。结论TREM1可能参与泡沫细胞的形成，与动脉粥样硬化（AS）斑块的发生发展密切相关，可能成为AS治疗的一个新的靶点或监测AS进展的一项新指标。【关键词】泡沫细胞；髓系细胞触发受体1；动脉粥样硬化　　泡沫细胞是动脉粥样硬化（AS）斑块内出现的特征性病理细胞，主要来源于血液单核细胞与血管中膜平滑肌细胞。越来越多的泡沫细胞堆积在一起形成脂质条纹乃至脂质斑块。U937是一种人淋巴瘤细胞，本质是单核细胞，体外细胞培养呈悬浮生长，经佛波酯刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，后者在含氧化型低密度

3、脂蛋白胆固醇（oxLDL）的培养液中培养可转化为泡沫细胞〔1〕。髓系细胞触发受体1（triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells1，TREM1）是一个30ku的糖蛋白，能诱使多种炎性因子和化学因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素8（IL8）和单核细胞趋化蛋白81（MCP1）的生成。因此，TREM1在调节中性白细胞和单核细胞的激活过程及炎症反应中处于较重要地位。但有关TREM1在单核细胞源性泡沫细胞中表达情况未见报道。本研究用PMA及o

4、xLDL诱导U937细胞向泡沫细胞转化，用RTPCR及Western印迹法探讨TREM1在此过程中的表达情况。　　1材料与方法　　1.1细胞来源及主要试剂　　U937细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司，系人单核细胞系，倍增时间为24～48h，在含10%小牛血清RPMI1640培养基中呈悬浮样生长。oxLDL由Yuanyuanbiotechnology提供。佛波酯购自Sigma公司。RPMI1640培养基和Trizol购自Gibco公司。MMLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、10mmol

5、/LdNTP、Oligo（dT）购自Fermentas公司。小鼠抗人TREM1单克隆体为Abnova公司产品，兔抗人GAPDH抗体为SantaCruz产品。ECL发光试剂盒为Millipore公司产品。其他试剂均为进口或国产分析纯。　　1.2U937细胞的分化及诱导8　　呈对数生长的U937细胞（细胞密度1.0×109/L），加入终浓为100nmol/LPMA，孵育72h，使其由单核细胞分化为巨噬细胞样U937细胞。用无血清培养液培养12h后，换成含oxLDL(终浓度为100mg/L)的培养液继

6、续培养24h，将上述巨噬细胞样U937细胞诱导为泡沫细胞。　　1.3油红O染色法鉴定U937泡沫细胞　　将贴壁生长的细胞用新鲜配制的0.3％油红O染色20min，苏木素染色5min，70％乙醇脱色及返蓝后，水溶性胶封片，镜下观察结果。　　1.4实验分组　　将经PMA诱导的U937细胞平均分为3组，分别为PMA诱导组，PMA+低密度脂蛋白（LDL）组和PMA+oxLDL组。每组设5个孔，分别用正常含10%小牛血清的RPMI1640培养液、含LDL终浓度为100mg/L的培养液及含oxLDL终浓度为

7、100mg/L的培养液培养24h，收集培养细胞进行RTPCR检测及Western印迹检测。　　1.5RTPCR法检测培养细胞中TREM1mRNA的表达8　　按Trizol说明书提取培养细胞总RNA，按逆转录酶提供的说明书进行逆转录反应。取逆转录模板2μl用于PCR，反应条件为cDNA预变性94℃5min后，经94℃30s，55℃30s；72℃30s共30个循环；循环结束后再72℃延伸10min。反应结束后取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭）电泳，紫外灯下照相，用凝胶成像

8、处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片段进行积分光密度扫描。以GAPDH密度作参考定量标准，各组光密度与其比值表示表达量强弱。根据GenBank提供数据设计引物。TREM1引物上游序列为5′TGCTGTGGATGCTCTTTGTC3′，下游序列为5′CACAGTTCTGGGGCTGGTAT3′，扩增片段长度为491bp；GAPDH引物上游序列为5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游序列为5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA