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时间:2018-08-01
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凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间测定的问题【摘要】就目前玻片法凝血时间和Duke氏出血时间测定已淘汰,迄今凝血试验中的凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)测定已有公认的标准化方案,简要介绍此两种时间测定的方法、标本采集、注意事项、临床意义等。【关键词】凝血酶;时间测定;凝血活酶 血栓与止血实验室检查的临床重要性与日俱增,检验内容不断扩大,工作量也日益增多,不断出现方法更新和试剂商品化、操作自动化,改变了以往靠手工操作、自配试剂、工作效率低的局面。过去的玻片法凝血时间和Duke氏出血时间测定已淘汰,迄今凝血试验中的凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)测定已有公认的标准化方案[1],并成为实验室检查的常规项目。 1玻片法凝血时间和Duke氏出血时间测定已淘汰 1.1凝血时间凝血时间是检测“内源”凝血系统相关因子缺陷的简易过筛试验。目前国内广泛使用的玻片法很不敏感,国外早在60年代即已淘汰。即使是被认为是较好的试管法,对第Ⅷ、第Ⅸ9 因子缺乏病例的阳性率也不高,而且操作繁琐。某些出血性疾病需要查凝血时间时,现已改用APTT代替[1]。 1.2出血时间出血时间是一种检测血小板数量、功能和毛细血管功能的过筛试验。目前我国临床常规实验室普遍采用的Duke氏法,甚不敏感。少数出血性疾病,例如血小板减少及功能异常及血管性血友病(vWD)等需要作BT时,应采用出血时间测定器法(改良的Ivy法);后者要求患者在上臂缚压脉带,充气并维持一定压力,再用特制的刺血刀具(目前这种刀具主要靠进口),切一标准切口,记录出血时间。操作繁琐、费时,不能列为常规。该法影响因素很多,Crowley等列举的主要因素有:技术操作、切口的方向和部位、皮肤的温度和Hct,特别是后者影响较大[2]。1991年LIND在《BLOOD》杂志上,发表了题为“出血时间不能预测外科出血”的文章[3]。1990年RODGERS和LEVIN也发表了文章,认为出血时间要重新评价[4]。该二文收集了大量评价出血时间临床应用价值的文献资料,认为这种方法(包括出血时间测定器法)对某些出血性疾病,特别是用于手术前预测出血,敏感性和特异性均不强。因此在外科术前不必将出血、凝血时间作为常规[1]。如果少数有出血史或出血体征,需作该项检查时,凝血时间改用APTT,出血时间用正规的出血时间测定器法。下面就简要介绍凝血酶原测定和部分活化凝血活酶测定的方法、原理和注意事项等[1]。9 2PT测定 2.1原理将凝血活酶和钙离子加到枸椽酸钠抗凝血浆中,37℃保温,测定血浆凝固时间(PT)。如果患者凝固时间延长,表示血浆中缺乏(或降低)某一种或几种凝血因子。本法主要用于过筛检测外源凝血途径依赖维生素K的第Ⅱ、第Ⅶ、第Ⅹ因子。另外,第Ⅴ因子和纤维蛋白原缺乏以及存在相关因子的抑制物时,也可出现异常结果。 2.2血液标本的采集、运送及贮存[1]用一次性塑料采血器或硅化玻璃注射器采静脉血液;采血技术要熟练,不可过多损伤血管及周围组织,致使组织液混入血液中;采血时止血带不可束缚过紧,并不应超过5min;针筒内见到血即应解开止血带,否则某些凝血及纤溶因子会活化,并可使红细胞比积(Hct)升高;血与枸椽酸钠抗凝剂按9∶1混合,轻轻颠倒混匀,防止不洁的试管和不合格橡皮塞的污染。贮血应用清洁塑料管或硅化玻璃管或其他不沾湿的容器,避免接触活化凝血因子;取得血液后应尽快送到血液检验室。在运送中应避免剧烈振动和日光直射;一般要求自采血到测定不得超过4h,不可久贮;如在室温中贮存过久,第Ⅴ因子会破坏;另一方面,在4℃贮存过久,会导致第Ⅶ因子活化。实验室在取得血样后应尽快分离血浆并尽快测定;血液如发现凝固,应弃去不用。9 2.3标本制备PT和APTT试验都必须用乏血小板血浆(PPP),分离血浆时要求相对离心力(2000~2500)Xg,离心30min。用浊度法测定终点的自动化凝血仪,溶血和较明显的黄疸及脂血均会影响测定结果。 2.4造成结果错误的原因[1] 2.4.1与标本或样品有关的问题血标本收集管注入血液过多或不足;患者红细胞比积>55%时未校正枸椽酸盐液体积;用了非规定的抗凝剂(如EDTA或草酸盐)或未加抗凝剂,或抗凝剂浓度不准确;用了已凝固、溶血、黄疸或脂血样品;血标本混匀不当或剧烈的混匀;采血器或贮血管不洁,已受到污染;污染了肝素。 2.4.2分析前的问题血标本送验延误或用了不合规定的容器和方法运送、处理或贮存血标本。 2.4.3与试剂有关的问题试剂己被污染;复溶时水或稀释剂加量不准确;复溶时未用规定的溶液;试剂在运输、贮存过程中由于处理不当而变质;试剂复溶后超过了规定的稳定期或试剂己超过有效期。 2.4.4分析过程的错误9 如保温时间不准确、温度、加试剂量以及操作步骤不准确等。 3活化APTT推荐方法 APTT是检测“内源”途径凝血因子缺陷的过筛试验,也是当前用于凝血因子治疗、肝素抗凝治疗监控以及检测狼疮抗凝物(一种抗磷脂自身抗体)的主要手段。其临床应用频率仅次于PT或与之相当。APTT是从复钙时间和部分凝血活酶时间(PTT)改良而来。它用脑磷脂(比PT测定用的凝血活酶少了蛋白质部分,故名部分凝血活酶)作为血小板代替物,加到PPP中,同时加入了活化第Ⅻ因子的激活剂。较之PTT,其凝固时间缩短,并且排除了血小板数量和功能对血浆凝固的影响。迄今为止,ICSH和ICTH尚未有APTT测定标准化或试剂标准化的方案,仅NCCLS于1992年提出了一个编号H29T的暂行规范[5]。以下是我国APTT测定标准化初步方案[1]。 3.1原理将一种脑磷脂(血小板替代物,即部分凝血活酶)和激活剂加到血浆中,经过保温后,加入适当浓度的钙离子。其纤维蛋白凝块形成的时间(以秒计),即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径和共同途径凝血因子的缺陷,如因子Ⅻ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ、PK、HMWK以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子的抑制物测定和肝素治疗的监控。 3.2测定步骤9 3.2.1样品采集样品的采取、贮存、运送与PT测定相同。注意:应用清洁的塑料或硅化玻璃采血器采血及贮血,防止凝血因子接触活化。 3.2.2标本制备标本(乏血小板的血浆)的制备与PT相同。注意:必须用PPP测定。 3.2.3温度水浴箱或电热块的温度为(37±1)℃,要经常检查温度是否准确。 3.2.4接触活化时间加激活剂活化Ⅻ因子的时间要保持一致。各仪器和试剂生产厂家的规定可能不一样,应严格按说明书要求进行。 3.2.5操作已预温(不超过30min)的APTT试剂一份,与预温(不超过10min)的待测血浆一份混合,立即开动秒表计时。至规定的接触活化时间(各商品要求不同)终了时,加入预温37℃的CaC12液一份,混匀,同时开动秒表。至出现血浆凝固时,停表记录血浆凝固时间(以秒计)。 4PT和APTT的临床意义[7]9 4.1血浆PT测定正常参考范围:正常PT为11s~14s,超过正常对照3s为异常。临床意义:PT延长见于先天性因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ缺乏症和低或无纤维蛋白原血症;获得性见于DIC、肝病、阻塞性黄疸、维生素K缺乏症、血循环中有抗凝物质或口服避孕药等。PT缩短见于高凝状态和血栓性疾病。 4.2活化APTT测定正常参考范围:35s~45s,临床意义:APTT较正常对照延长10s以上有意义。本试验较CT敏感,凡参与血浆凝血活酶生成的各种因子缺乏时,均可引起APTT延长,尤其Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ因子含量减少所致的各种血友病时多见延长,能检出因子Ⅷ:C<25%的轻型血友病。凝血酶原、纤维蛋白原严重减少以及有抗凝物质存在时亦可延长。也可作为血友病治疗和抗凝药物治疗过程中的观察指标之一。APTT缩短见于DIC高凝期、血小板增多症等。 5活化的APTT和血浆PT可见下列4种情况[6] 5.1APTT和PT都正常除正常人外,仅见于遗传性和继发性因子Ⅹ、Ⅲ缺乏症。获得性者常由于严重肝脏疾病、肝脏肿瘤、恶性淋巴瘤、包括白血病、抗因子Ⅹ、Ⅲ抗体、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血等引起。 5.2APTT延长伴PT正常9 多数是由于内源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病,如血友病A、血友病B、因子Ⅺ缺陷症;血循环中有抗因子Ⅷ、抗因子Ⅸ或抗因子Ⅺ抗体存在;DIC时可见因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ减低,肝脏疾病时可见因子Ⅸ、Ⅺ减少,口服抗凝剂时可见因子Ⅸ减低、vWD等。 5.3APTT正常伴PT延长多数是由于外源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅶ缺陷症,获得性者常见于肝脏疾病、DIC、血循环中有抗因子Ⅶ抗体存在和口服抗凝剂等。 5.4APTT和PT都延长多数是由于共同途径凝血缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅹ、Ⅴ、凝血酶原(因子Ⅱ)和纤维蛋白原(因子Ⅰ)缺陷症,获得性者主要见于肝脏疾病和DIC,口服抗凝剂时可有因子Ⅹ和凝血酶原减低。此外,血循环中有抗因子Ⅹ、抗因子Ⅴ和抗因子Ⅱ抗体存在时,它们也相应地延长。临床应用肝素治疗时,APTT和PT也都会延长。【参考文献】 [1]朱忠勇.凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间测定标准化[J].中华医学检验杂志,1998,21(5):308312.9 [2]CrowlyJP,MetzgerJB,ValeriCR.TheVolumeofBloodShedDuringtheBleedingTimeCorrelateswiththePeripheralVenousHematocrit.AmJClinPathol,1997,108:579584. [3]LindSE.TheBleedingTimeDoesNotPredictSurgicalBleeding.Blood,1991,77:25472552. [4]RodgersRPC,LevinJ.ACriticalReappraisaloftheBleedingTime.SeminThrombHaemost,1990,16:120. [5]NCCLS.DocumentH29T(tentativeguideline).ActivatedPartialThromboplastinTest(APTT),1992,12:22. [6]王鸿利.出血的实验诊断[J].上海第二医科大学瑞金医院上海血液学研究所. [7]杨春生,宋乃国.临床检验学[M].天津科学技术出版社,1998,(1):3943.9
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