乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析

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1、乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析【摘要】目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3024bp的乳糖酶基因，利用生物软件分析，推测乳糖酶基因共编码1008个氨基酸，蛋白分子量为114KDa，等电点为4.9，氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步

2、研究及低成本表达该酶奠定基础。【关键词】乳糖酶基因；克隆；生物信息学分析［ABSTRACT］Objective:TocloneandanalyzelactasegenefromLactobacillusdelbrueckiibulgaricus.Methods:ClonedlactasegenefromLactobacillusdelbrueckiibulgaricuswithPCR,madesequencingandbioinformaticsanalysis.Results:Clonedlactasegene(3024

3、bp)successfully.Itwaspresumedthatthelactasegeneencode1008aminoacids,withproteinmolecule114KDa,isoelectricpoint4.9,9potentialglycosylationsitesinaminoacidsequence.Madehomologycomparisonwithotherlacteses.Conclusion:Thelactasegeneisclonedsuccessfully9andthebioinforma

4、ticsanalysisismadebybiologicalanalysissoftwaretoinvestigateitscharacter.Itprovidesfoundationforfurtherstudyandcolonizationatlowcost.［KEYWORDS］Lactasegene;Clone;Bioinformaticsanalysis乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食

5、品［1］。除此之外，在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物，对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效，特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而，人体却不能直接利用乳糖，它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现，世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏，东方人乳糖酶缺乏高达85%［2］，从而导致“乳糖不耐症”的发生。乳糖酶(EC3．2．1．23，又名β半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖

6、，并具有半乳糖苷的转移作用［3］。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”9问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中，大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而，不同来源的乳糖酶，其酶学性质相差很大。本研究从保加利亚德氏乳杆菌中成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与质粒保加利亚德氏乳杆菌购买于广东省微生物研究所菌种保

7、藏中心；大肠杆菌DH5α由本室保存；pGMTvector购于北京天根生化科技有限公司。1.1.2试剂材料细菌培养试剂购于Sigma公司；引物由上海生工合成；LADNA聚合酶购于自大连宝生物公司；细菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、DNALadder购于北京天根生化科技有限公司；T4连接酶、琼脂糖、荧光染料由本室保存。1.2方法1.2.1保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA的提取9用灭菌双蒸水溶解干冻管里的保加利亚德氏乳杆菌，并划平板到MRS固体培养基，37℃培养72h，挑取单个菌落于MRS液体培养基进

8、行增菌（37℃摇床）。利用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。1.2.2引物设计与合成从GenBank数据库中检索到保加利亚德氏乳杆菌中乳糖酶基因序列（GenBank序列号：GI149564）设计引物如下：P1：5'5'CGCGGATCCGCGAT