一个als家系突变sod1的表达及其空间构象的分析

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1、一个ALS家系突变SOD1的表达及其空间构象的分析作者：胡俊吴亚光王峰超李露斯陈康宁史树贵【摘要】目的：对一个肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)家系的突变铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxidedismutase，SOD1)基因进行研究，了解其与野生型SOD1在不同部位神经组织中表达的差异性。采用软件进行模建，对突变SOD1蛋白质的二、三级结构进行预测和分析。方法：采用Northern杂交对突变SOD1mRNA进行分析;克隆出突变SOD1cDNA和野生型SOD1cDNA，采用含有人多种神经组织mRNA的预制Norther

2、n杂交膜，了解突变SOD1与野生型SOD1在不同部位神经组织中表达的差异性;采用软件对突变蛋白质的二、三级结构进行模建分析。结果：Northernblot分析证实2号外显子mRNA缩短。野生型和突变的SOD1基因具有相似的组织表达差异性，在大脑皮层表达最高，在脊髓表达最弱。突变后的SOD1蛋白质二级、三级结构与野生型SOD1基本相似。结论：突变后SOD1酶活性的功能下降可能是引起该家系发病的原因，SOD1基因在不同神经组织表达的差异性，可能是该家系ALS患者临床表现以下运动神经元损害为主的原因。【关键词】肌萎缩侧索硬化症;铜锌超氧化物歧化酶;表达;空间构象13我们在重庆地区发现一

3、个常染色体显性遗传的肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)大家系[1]，该家系临床表型与目前文献报道的FALS家系临床表型有差异，表现为：(1)以下运动神经元损害为主要临床表现，有明显的前角细胞刺激症状，躯干及四肢肌肉明显萎缩，以肢体末端肌肉萎缩最显著，后期手足畸形呈“爪形手”、“弓形足”;(2)上运动神经元损害轻微，在8例存活的患者中，仅2例腱反射活跃或亢进，1例病理反射阳性，另1例病理反射可疑阳性。我们对该家系成员的铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxidedismutase，SOD1)基因的5个外显子进行突变位点的筛查，

4、发现部分家系成员的2号外显子插入了一个碱基A，我们认为这一新的SOD1突变类型可能是引起该家系发病的主要原因[1，2]。我们对这一新的突变SOD1进行研究，了解其与野生型SOD1在结构上以及不同部位神经组织中表达的差异性，并采用软件分析其二级、三级空间结构，为进一步研究该家系的发病机制提供理论基础。　　1材料和方法　　1.1材料：家系成员(见图1)外周血标本，TriPureIsolationReagents购自美国Roche公司。PCR产物纯化试剂盒购自上海华禹生物工程公司。RNA酶抑制剂、反转录酶AMV及缓冲液、OligoDT购自Promega公司。LambdaDNA/Hind

5、Ⅲmarkers、PCR13markers购自华美生物工程公司。DL2000LadderMarker购自北京天为时代科技有限公司。BD2000LadderMarker购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。32P标记的dCTP试剂盒购自北京福瑞公司。PCR引物由上海博亚公司合成。　　图1该ALS家系图谱　　1.2实验方法　　1.2.1家系成员Northern杂交　　(1)外周血总RNA抽提：分别抽取家系成员：Ⅱ5、Ⅲ12、Ⅲ11、Ⅲ9、Ⅲ7、Ⅲ20、Ⅲ1、Ⅲ5、Ⅲ4、Ⅱ11、Ⅲ3、Ⅳ2、Ⅲ2、Ⅳ6、Ⅲ13静脉血5ml，采用TriPureIsolationReagents总RNA

6、提取试剂盒提供的方法提取外周血白细胞总RNA。　　(2)标记探针：采用随机寡核苷酸引物合成DNA探针，在一个PCR反应管中加入待标记片断1μl(约200ng)和随机引物11μl(约75ng)，置沸水中煮3min后放入冰水冷却;加5单位(约1μl)的大肠杆菌聚合酶IKlenow片段，室温下温浴至少3h。13　　(3)RNA电泳：制备凝胶和样品，随后将样品加至凝胶加样孔，将凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，3-4V/cm电压降进行电泳，溴酚蓝迁移出约8cm结束电泳。　　(4)转膜：按Southernblot转膜方法进行转膜，室温真空中保存。　　(5)杂交：用杂交溶液于42℃进行预杂交

7、，时间1～2h。在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，在适宜的温度下继续温育16～24h。　　(6)信号检测：室温洗膜20min，随后68℃洗膜3次，每次20min;用X光片(Kodak)进行放射自显影，附加增感屏，-70℃曝光24-48h取片冲洗。使用Gel分析系统对杂交影像进行扫描分析，测定每个杂交信号的强度。　　1.2.2SOD1cDNA在多种人神经组织中的表达　　(1)逆转录合成SOD1cDNA：按分子克隆的方法分别得到野生型和突变的SOD1cDNA。　　(2)hSOD1